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傳代細(xì)胞培養(yǎng)的視頻拍攝腳本

一、 實驗準(zhǔn)備
器材
液氮冷凍灌、 恒溫培養(yǎng)箱、 電冰箱、高壓滅菌鍋、磁力攪拌器離心機(jī)、 分析天平、倒置顯微鏡、 超凈工作臺、彎頭吸管(1個)、膠頭滴管(9個)、  離心管(9個)、 帶塞培養(yǎng)瓶(不定個)、 試管架、 量桶、 燒杯、酒精燈、 抽濾瓶、G6型號細(xì)菌過濾漏斗、帶塞小玻璃瓶,大三角瓶 、無菌凍存管、液氮瓶
(一)、器皿
1玻璃器皿的清洗滅菌:
種類:小玻璃瓶、彎頭吸管、滴管(3個)、培養(yǎng)瓶、量桶、 燒杯、抽濾瓶、大三角瓶,細(xì)菌過濾器接口管
藥品:5%鹽酸溶液、重鉻酸鉀120ml、硫酸200ml、蒸餾水200ml
(1)浸泡:新使用或重復(fù)使用的玻璃器皿須經(jīng)5%鹽酸溶液或自來水浸泡過夜或煮沸30min,水洗。以去除新購進(jìn)玻璃器皿所帶有灰塵、鉛、砷等物質(zhì),并消除其弱堿性。
鏡頭一:實驗人員將器皿放進(jìn)加有5%鹽酸溶液的盆內(nèi),并以字幕和配音的形式顯示浸泡或煮沸時間和浸泡目的)
(2)刷洗:浸泡后用軟毛刷和優(yōu)質(zhì)的洗潔精進(jìn)行刷洗。刷洗后經(jīng)行烘干
鏡頭二:實驗人員刷洗器皿,使用正規(guī)的清洗方法,并烘干,只示范其中2--3種即可,實驗人員必須介紹操作示范烘干箱的使用方法和相關(guān)數(shù)據(jù)的設(shè)置方法)
(3)酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前須適當(dāng)晾干或烘干,以免造成酸浸液稀釋,影響效果。將玻璃制品完全浸泡入清潔液中24h。清潔液具有極強(qiáng)酸蝕作用,操作過程需戴防護(hù)用具。
(鏡頭三:帶好橡膠手套將清潔液加入到盆中,讓后進(jìn)行酸浸,并以字幕的形式顯示浸泡時間)
(4)沖洗、烘干備用:浸酸后的玻璃器皿先用自來水充分沖洗,吸管需沖洗10min,器皿需每瓶灌滿自來水、倒掉反復(fù)10次以上,不留任何酸浸液殘跡,然后用蒸餾水漂洗2~3次
將清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中,烘干后的玻璃器皿要求干凈透明,無油煙,不能殘留任何有害物質(zhì)及化學(xué)藥品等。
鏡頭四:自來水沖洗,蒸餾水清洗,烘干一起完成,在這個過程中可在裝器皿的盤中放入一定量的玻璃器皿,只對其中一種進(jìn)行自來水沖洗、蒸餾水清洗,洗好后就將所有儀器放入烘干箱中烘干,并在每一個步驟中以字幕或語音的形式顯示相關(guān)操作次數(shù)和時間)
(5)包裝滅菌:器材經(jīng)清洗烤干或晾干后,先應(yīng)嚴(yán)格包裝,然后再行消毒滅菌處理,以防止消毒滅菌后再次遭受污染。包裝材料常用包裝紙、牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、玻璃或金屬制吸管筒、紙繩等。
鏡頭五:實驗人員對實驗器皿中的1—2種進(jìn)行包裝示范,然后將其他包裝過的器皿一起放入高壓蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行滅菌)
(實驗人員必須示范操作高壓滅菌鍋和恒溫干燥箱的用法,示范操作步驟,只示范一次即可,在下面的不同滅菌溫度和不同滅菌時間可以字幕的形式顯示)
2、橡膠制品清洗消毒
種類:玻璃瓶橡膠塞、培養(yǎng)瓶瓶塞、皮管、滴管頭
新的橡膠制品洗滌方法:0.5mol/L NaOH煮沸15分鐘,流水沖洗,0.5mol/L HCl煮沸15分鐘,流水沖洗,自來水煮沸2次,蒸餾水煮沸20分鐘,50℃烤干備用
(鏡頭:0.5mol/L NaOH煮沸,流水沖洗,0.5mol/L HCl煮沸,流水沖洗,自來水煮沸2次,蒸餾水煮沸20分鐘各一個鏡頭,因為在上面已經(jīng)示范過干燥箱和滅菌鍋的操作方法,在使用干燥箱和高壓滅菌時只需以字幕的形式顯示烘干溫度、滅菌溫度、滅菌時間即可)
 
3、塑料制品的清洗消毒
種類:瓶蓋、離心管
塑料制品特點:質(zhì)軟、易出現(xiàn)劃痕;耐腐蝕能力強(qiáng)、但不耐熱。
清洗程序:使用器皿后立即用清水清洗,浸于自來水過夜,用紗布或棉簽和50℃清洗液刷洗,流水沖洗,晾干,浸于清潔液15分鐘,流水沖洗(15-20遍),蒸餾水浸洗三次,雙蒸水泡24小時,晾干備用。
(因在器皿的準(zhǔn)備過程中玻璃制品是**主要的,故塑料制品的清洗和消毒滅菌的方法可用字幕的方法顯示出來)
(注意:各種不同材質(zhì)器具的不同滅菌時間?溫度設(shè)置?)
2、試劑準(zhǔn)備
試劑 :RPMI l640培養(yǎng)液, 小牛血清(生長因子), 胰蛋白酶液,75%乙醇(消毒),凍存培養(yǎng)液(培養(yǎng)液7ml,小牛血清2ml,DMSO 1ml),PBS緩沖液等。
重點配置的藥品:RPMI l640培養(yǎng)液、0.2%胰蛋白酶液。
藥品:RPMI l640 培養(yǎng)粉、雙蒸水、HEPES、碳酸氫鈉、青霉素、鏈霉素;typsin粉末。
器材:大三角瓶、移液槍及槍頭、無菌EP管、無菌室、無菌操作臺、磁力攪拌器、G6型號細(xì)菌過濾漏斗、細(xì)菌過濾漏斗、冰箱。
 
(1) RPMI l640基礎(chǔ)培養(yǎng)液的配制 :
稱取RPMI l640 培養(yǎng)粉 10.4g溶于1,000 mL雙蒸水中,磁力攪拌器攪拌40min. 加HEPES 2、4g。攪拌十分鐘,2g碳酸氫鈉 攪拌十分鐘 。過濾前要加雙抗  加入雙抗****終濃度為 100單位/mL。過濾 
經(jīng)G6型號細(xì)菌過濾漏斗抽濾后備用
1、取RPMI l640培養(yǎng)粉10.4g,加入1L雙蒸水于磁力攪拌器下攪拌40min
2、加入HEPES 2、4g,再次攪拌溶解10min,再加入2g碳酸氫鈉,攪拌十分鐘(每一步一個鏡頭一個配音說明即可,每一步驟6s左右時間)#p#分頁標(biāo)題#e#
3、無菌實驗室打開紫外燈,紫外滅菌30min(可配音說明,6s左右)
4、人工消毒準(zhǔn)備,無菌操作臺酒精擦拭滅菌
鏡頭:實驗人員穿上無菌實驗室操作服用戴上橡膠手套,然后就位用酒精棉球消毒試驗臺)
5、將滅過菌的細(xì)菌過濾器進(jìn)行組裝
    (鏡頭:細(xì)菌過濾器的滅菌時間和滅菌溫度可以配音或字幕的形式顯示)
6、在無菌工作臺上在培養(yǎng)基中加入雙抗,并混勻,配成各100單位/ml雙抗,混合后經(jīng)行細(xì)菌過濾器過濾,并示范操作
7、將滅過菌的小玻璃瓶于試驗臺上解封,取下封口紙,將小玻璃瓶瓶口于酒精燈上過火,分裝培養(yǎng)基,裝好后再次過火,用過火后的橡膠塞塞緊,并編號,寫上配置時間和配置人(每瓶90ml,只示范一個即可)
8、將封裝好的培養(yǎng)液放入4℃冰箱中存放備用。
(在這幾個步驟中每一步均以10s左右的視頻時間演示,再加上培養(yǎng),然后切入下一個步驟)                                                                                                                                                                                                                                                                                           
(2)胰酶的配制: 稱取適量typsin粉末配制成0.1%--0.25%的濃度(0.006gtypsin粉末+3ml 雙蒸水),配制時要使用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡鹽溶液(如D-hank's溶液),因為這些物質(zhì)都會對胰酶產(chǎn)生抑制作用,胰酶無菌過濾時胰酶量多不銹鋼過濾,量少時用抽提過濾 。
二 、實驗臺準(zhǔn)備,實驗人員就位
消毒劑:操作者的皮膚、培養(yǎng)瓶的蓋和外壁常用碘酒、酒精消毒。無菌室內(nèi)桌椅和物體的消毒可用過氧乙酸、來蘇兒等擦拭或浸泡。
紫外線:主要用于消毒實驗室空氣、工作臺面和一些不能使用其他方法消毒的培養(yǎng)器皿。進(jìn)無菌室前或做完實驗后,均應(yīng)開燈照射30min進(jìn)行消毒。紫外線照射60min可以消滅空氣中大部分細(xì)菌。
鏡頭:在紫外線燈照射下的超凈工作臺和實驗室一個鏡頭)
三 、復(fù)蘇細(xì)胞
原理:凍存細(xì)胞保存管保存在液氮中(-196℃),取出保存管后必須快速冷凍,以避免冰晶重新結(jié)晶而對細(xì)胞造成傷害,致使細(xì)胞死亡。在凍存細(xì)胞的保存管中含有對細(xì)胞有毒害的成分DMSO,故在解凍應(yīng)馬上將其去除。在冷凍活化前應(yīng)在無菌臺上將細(xì)胞培養(yǎng)液配好,然后將保存管從液氮中取出,放于37℃的溫水中快速使細(xì)胞解凍。解凍后懸液快速移入培養(yǎng)液中混勻,離心去掉上清液,再加入細(xì)胞培養(yǎng)液。
材料:凍存的Hela細(xì)胞
器材:帶塞培養(yǎng)瓶、離心管(3只)、膠頭滴管(3只)、1ml移液槍、1ml移液槍頭、燒杯、酒精燈、試管架、離心機(jī)、無菌操作臺、恒溫培養(yǎng)箱
藥品:RPMI l640培養(yǎng)液、小牛血清、酒精
鏡頭一:細(xì)胞解凍與活化(每一步為一個鏡頭)
實驗人員穿上無菌實驗室操作服用酒精噴于手上消毒,然后就位用酒精棉球擦拭實驗臺
(1)取一離心管用滴管在其內(nèi)滴加5--9ml培養(yǎng)液。                                                                                            
(2)從液氮罐中取出凍存管,并迅速放入36℃~37℃水浴,不時搖動,使其急速融化,30~60s內(nèi)完成。
(3)凍存管用70%酒精擦拭消毒后,打開蓋子,用吸管將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移入上述離心管中。
(4)低速離心(1200r/min) 6min,去上清后再用5--9ml培養(yǎng)液再清洗離心一次。
鏡頭二:裝瓶培養(yǎng)
(1)離心后去掉上清液,在離心管中滴加內(nèi)滴加3ml培養(yǎng)液(RPMI-1640),混勻。#p#分頁標(biāo)題#e#
(2)將離心管中的混合液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中,并在培養(yǎng)瓶中滴加15滴小牛血清(是小牛血清為10%的濃度),蓋上瓶蓋,將培養(yǎng)瓶平放,置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
 
四、傳代培養(yǎng)及其操作步驟
原理:細(xì)胞在體外培養(yǎng)時,為使其生長狀況與其在體內(nèi)生長狀況相似,必須在體外模擬體內(nèi)生長的環(huán)境條件。一是提供細(xì)胞存活的必須條件,如適量的水、無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其他相關(guān)的生長因子,還需要氧氣、適宜的溫度、適宜的酸堿度、適宜的滲透壓,動物細(xì)胞還要加入適宜的血清。
當(dāng)觀察到培養(yǎng)瓶中細(xì)胞鋪滿度為90%時(細(xì)胞生長處于對數(shù)期時),解凍復(fù)活成功后的細(xì)胞要進(jìn)行分離培養(yǎng),否則細(xì)胞會因生存空間不足或密度過大,營養(yǎng)障礙,影響細(xì)胞生長。細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的過程稱之為傳代培養(yǎng)。傳代細(xì)胞細(xì)胞株的**大利處在于提供了大量持久的實驗材料,便于實驗。
材料:培養(yǎng)瓶中處于對數(shù)期的Hela細(xì)胞
器材:帶塞培養(yǎng)瓶2—3個、離心管(3只)、膠頭滴管(3只)、彎頭滴管、1ml移液槍、1ml移液槍頭、燒杯、酒精燈、試管架、離心機(jī)、無菌操作臺、恒溫培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡
藥品:RPMI l640培養(yǎng)液、0.2%胰蛋白酶液、小牛血清、酒精
 
鏡頭一:制細(xì)胞懸液
(1)試驗臺的消毒工作準(zhǔn)備好,盡量吸掉或倒掉培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液,以免剩余培養(yǎng)液影響胰蛋白酶活性。
(此處消毒同上,消毒步驟可省略不拍,以配音的方式說明在實驗前已進(jìn)行試驗臺的消毒,關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)的換液再次可以做一個說明示范)
(2)向瓶內(nèi)加入胰蛋白酶液1ml,置于37℃孵箱或室溫(25℃溫度)下進(jìn)行消化,1--3min后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察,當(dāng)發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后,應(yīng)立即中止消化。
(4)吸出消化液,向瓶內(nèi)用滴管加入培養(yǎng)液少量,輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶,把殘留胰蛋白液消化液沖掉,然后再少量含血清的加培養(yǎng)液(要加多少?)。
(5)使用吸管,吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液,按順序反復(fù)輕輕吹打瓶壁細(xì)胞,使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。吹打時動作要輕柔,以防用力過猛損傷細(xì)胞。
(6)將準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中,離心(1200r/min) 6min
注意事項:
掌握好細(xì)胞消化的時間,消化時間過短時,細(xì)胞不易從瓶壁脫落,過長的消化會導(dǎo)致細(xì)胞脫落、損傷。若細(xì)胞沒有脫壁,生長良好,則直接倒掉消化液,加培養(yǎng)液5--9ml,離心收集細(xì)胞;若發(fā)現(xiàn)很多細(xì)胞已解離已脫壁(即解離過度),則直接加培養(yǎng)液進(jìn)行離心收集細(xì)胞。
掌握好消化濃度,當(dāng)消化液濃度過高時,消化時間應(yīng)縮短,過低時細(xì)胞消化時間相對延長。
 
鏡頭二:細(xì)胞分裝
(1)將離心后離心管中液體倒掉,在離心管中加入3ml培養(yǎng)液,并反復(fù)吹打細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液。
(2)取3個無菌培養(yǎng)瓶,酒精棉球擦拭消毒,并在酒精燈下過火消毒。
(3)在培養(yǎng)瓶中各加入1ml細(xì)胞懸液、2ml培養(yǎng)液(用移液槍)、15滴小牛血清,加好后酒精燈下過火加塞。
細(xì)胞培養(yǎng)換液時間應(yīng)根據(jù)細(xì)胞生長的狀態(tài)和實驗要求來確定。一般2~3d后應(yīng)換一次生長液。待細(xì)胞鋪滿器皿底面,即可使用;也可繼續(xù)傳代擴(kuò)大培養(yǎng)或換成維持液。
五 、培養(yǎng)細(xì)胞的凍存
原理:細(xì)胞的凍存**常用的方法是液氮冷凍保存法,主要是加入適量的保護(hù)劑緩慢的冷凍細(xì)胞。由于細(xì)胞在不加任何保護(hù)劑的情況之下,細(xì)胞內(nèi)外水分會很快結(jié)成冰晶,從而引起一系列不良反應(yīng)。如細(xì)胞脫水使局部電解質(zhì)濃度升高,PH值改變,部分蛋白質(zhì)因此變性使細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂,溶酶體膜被破壞而放出大量酶將細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞。因此在細(xì)胞凍存時的關(guān)鍵是盡可能減少細(xì)胞內(nèi)水分,減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,故凍存時采用甘油或DMSO做保護(hù)劑,這兩種物質(zhì)分子量較小,溶解度大,易穿透細(xì)胞,可使冰點下降,提高細(xì)胞膜對水的通透性,對細(xì)胞毒害作用小,梯度慢速冷凍可使細(xì)胞內(nèi)水分滲出細(xì)胞外,減少形成冰晶對細(xì)胞產(chǎn)生的傷害。
細(xì)胞低溫凍存是培養(yǎng)室常規(guī)工作和通用技術(shù)。細(xì)胞凍存在-196℃液氮中,儲存時間幾乎是無限的。細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的原則是慢凍快融。
材料:培養(yǎng)瓶中處于對數(shù)期的Hela細(xì)胞
器材:帶塞培養(yǎng)瓶2—3個、離心管(3只)、無菌凍存管、膠頭滴管(3只)、彎頭滴管、1ml移液槍、1ml移液槍頭、燒杯、酒精燈、試管架、離心機(jī)、無菌操作臺、恒溫培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、冰箱
藥品:RPMI l640培養(yǎng)液、0.2%胰蛋白酶液、10%DMSO、小牛血清、酒精、液氮瓶
鏡頭一:細(xì)胞懸液的制作
(1)選對數(shù)增生期細(xì)胞(細(xì)胞鋪滿度為90%左右時),在凍存前1d換液。
(2)試驗臺的消毒工作準(zhǔn)備好,吸掉或倒掉培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。
(3)向瓶內(nèi)加入1ml 0.25%胰蛋白酶液,以能覆蓋培養(yǎng)瓶底為宜。
(4)置37℃孵箱或室溫(25℃溫度)下進(jìn)行消化,2--3min后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察,當(dāng)發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后,應(yīng)立即中止消化。
(5)吸出消化液,在吸除胰蛋白液后,直接加入3ml培養(yǎng)液+15滴小牛血清,終止消化。#p#分頁標(biāo)題#e#
(6)使用彎頭吸管,吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液,按順序反復(fù)輕輕吹打瓶壁細(xì)胞,使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。吹打時動作要輕柔,以防用力過猛損傷細(xì)胞,按常規(guī)方法把培養(yǎng)細(xì)胞制備成懸液,計數(shù),使細(xì)胞密度達(dá)左右密度
(7)將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中,(1200r/min) 6min,去掉上清液。
鏡頭二:凍存
(1)配制含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液(培養(yǎng)液7ml,小牛血清2ml,DMSO 1ml),于離心管中加入1ml凍存液,加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液,用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻,一個培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞只加入一個凍存管。
(2)將細(xì)胞懸液分裝入無菌凍存管中,每管1~1.5 ml(凍存液要先預(yù)冷到4℃ );在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱,凍存時間及操作者。
(3)凍存:標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序為降溫速率-1~-2℃/ min;當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時,可增**-5℃~-10℃/ min;到-100℃時,則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2h ,然后放入液氮氣中過夜,取出凍存管,移入液氮容器內(nèi)。
凍存:在特殊的儀器或簡易的液氮容器中,按-1℃/min的速度,在30~40min時間內(nèi),下降到液氮表面,再停30min后,直接投入液氮中。要適當(dāng)掌握下降冷凍速度,過快能影響細(xì)胞內(nèi)水分透出,太慢則促進(jìn)冰晶形成。
操作時應(yīng)戴防護(hù)眼鏡和手套,以免液氮凍傷。
 
 
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