一、名詞解釋
1、 細胞培養技術： 指從體內組織取出細胞在體外模擬體內的環境使其生長繁殖，并維持其結構和功能的一種培養技術
2、 原代培養：取自體內新鮮組織并置于體外條件下生長的細胞在傳代之前稱為原代培養。    
3、 傳代培養：細胞在培養器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養器皿中。
4、 細胞系：原代細胞**傳代成功后即可成為細胞系
5、 細胞株：通過選擇法或克隆法形成法從原代培養物或細胞系中獲得特殊性質或標志，并保持這些特性的培養物。
6、 培養用液：培養液是維持細胞生存和生長所需的基本溶液。除培養液外，還有各種雜用液。培養用液主要分為三類：平衡鹽溶液、天然培養基、合成培養基。
7、 天然培養基：在細胞培養中使用**早，也**有效，主要來自動物體液或從組織中分離提取制備的成分，其營養性較高，但成分復雜，個體差異較大，另外在來源上也有一定的限制。
8、 貼壁依賴性：細胞生長時需要附著于某些帶適量正電荷的固體或半固體表面，大多數動物細胞體外培養時，均以此種方式生長。
9、 合成培養基：按人和動物體內細胞所需成分模擬合成的、配方恒定的一種較理想的培養基。但對動物細胞來說，它也只能維持細胞的生存，要想使細胞生長和增殖，還需補充部分天然培養基，即把兩者混合在一起使用，效果才更好。合成培養基的出現，促進了組織培養的發展，減少了生物個體差異的影響。
10、 平衡鹽溶液BSS ：是從Ringer 生理鹽水發展起來的，主要由無機鹽和葡萄糖組成。BSS 中的無機離子不僅是細胞生命所需成分，而且對維持滲透壓、緩沖和調節溶液的酸堿度方面，起著重要作用。
 
二、簡答題
1、細胞凍存與復蘇要點與注意事項
細胞凍存要點
　　(1)冷凍過程要緩慢.需要冷凍保存的細胞先在4℃冰箱中放置 30-60分鐘;然后轉入-20℃,放置30分鐘;然后再轉入-80℃放置16-18小時(或過夜);**后放入液氮中長期保存.有條件的地方,可用程控降溫儀,按每分鐘-1 到 -3℃速度降溫,一直到-80℃以下,然后直接放入液氮中長期保存.
　　(2)凍存細胞必須處在對數生長期,活力大于90%,無微生物污染.
　　(3)細胞濃度控制在:1×107-5×107/ml.
　　(4)使用高濃度血清或蛋白保護劑.一般情況下,用于冷凍保存完全細胞生長培養液中血清濃度大于20%.
(5)使用合適的細胞冷凍保護劑,以保護細胞在冷凍過程中免受冰晶破壞.目前,**常用的冷凍保護劑是DMSO(二甲基亞砜),使用終濃度為5-10%.但是,有些細胞系不能用DMSO作為冷凍保護劑,如人白血病細胞系HL-60.因為,DMSO能誘導HL-60細胞分化.在這種情況下,可選用其它冷凍保護劑,如甘油(glycele),羥乙基淀粉等. 　
注意事項 
　　(1)細胞在冷凍過程中在-20℃冰箱內放置時間不可超過1小時,以防止冰晶過大而破壞細胞.也可跳過-20℃這一步驟直接放入-80℃冰箱中,但這樣做細胞存活率要低一些.
　　(2)DMSO稀釋時會釋放大量熱量.因此,DMSO不能直接加到細胞液中,必須事先配制.
　　(3)DMSO 必須是細胞培養級別的.新買的DMSO本身處于無菌狀態,**次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管或瓶中,4℃保存.避免反復凍融造成DMSO裂解產生有害物質.并可減少污染機會.如要過濾DMSO,必須選用耐DMSO的尼龍濾膜. 細胞冷凍保存液主要成分:冷凍保護劑,基礎培養液,血清或蛋白.
冷凍保存細胞復蘇要點與注意事項:
　　細胞復蘇要點
(1)從液氮中取出凍存的細胞,立即放入37℃水浴中快速解凍.
　　(2)將1-2ml 凍存細胞液加入到25ml新鮮完全細胞生長培養液中,輕輕混勻.
　　(3)用80g 離心2-3分鐘,棄上清液.
　　(4)用完全生長培養液輕輕懸浮細胞團,并計數細胞.
(5)接種細胞到培養瓶中,起始密度為3×10⁵/ml.
     注意事項 
　　(1)解凍時務必注意安全,預防冷凍管爆裂.,要帶手套,用鑷子將細胞冷凍管從液氮中取出,放入37℃水浴中.切不可直接用手,以免凍傷.
　　(2)冷凍管在水浴中解凍時,液面不可超過凍存管蓋面,否則,易發生污染.
　　(3)快速解凍.凍存細胞從液氮中取出后,應立即放入37℃水浴中,輕輕搖動冷凍管,使其在1分鐘內全部融化(不要超過3分鐘).
　　(4)解凍操作過程動作要輕.由于冷凍保存過的細胞變得非常脆弱,不僅解凍速度要快,而且動作要輕.一般情況下,解凍后的細胞可直接接種到含完全生長培養液的細胞培養瓶中直接進行培養(1ml 凍存細胞液加入到25-30ml新鮮完全培養液中),24小時后再用新鮮完全培養替換舊培養液,以去除DMSO.如果,細胞對冷凍保護劑特別敏感,那么,解凍后的細胞應先通過離心去除冷凍保護劑,然后再接種到含完全生長培養液的培養瓶中.
2、細胞培養基本條件
（1）合適的細胞培養基
　　合適的細胞培養基是體外細胞生長增殖的**重要的條件之一,培養基不僅提供細胞營養 和促使細胞生長增殖的基礎物質,而且還提供培養細胞生長和繁殖的生存環境.#p#分頁標題#e#
（2）優質血清 
　　目前,大多數合成培養基都需要添加血清.血清是細胞培養液中**重要的成分之一,含有細胞生長所需的多種生長因子及其它營養成分.
（3）無菌無毒細胞培養環境 
　　無菌無毒的操作環境和培養環境是保證細胞在體外培養成功的shou要條件.在體外培養 的細胞由于缺乏對微生物和有毒物的防御能力,一旦被微生物或有毒物質污染,或者自身代謝物質積累,可導致細胞中毒死亡.因此,在體外培養細胞時,必須保持細胞生存環境無菌無毒,及時清除細胞代謝產物.
（4）恒定的細胞生長溫度 
　　維持培養細胞旺盛生長,必須有恒定適宜的溫度.
（5）合適的氣體環境 
氣體是哺乳動物細胞培養生存必需條件之一,所需氣體主要有氧氣和二氧化碳. 細胞培養基種類與基本成分 細胞培養基的種類很多,按其來源分為合成培養基和天然培養基(目前使用的培養基jue大部分是合成培養基),按其物質狀態分為干粉培養基和液體培養基兩類.干粉培養基需由實驗者自己配制并滅菌,液體培養基由專業商家提供,用戶可直接使用,非常方便.每種細胞都有其合適的培養基,
3、常用的合成培養基種類
(1).MEM細胞培養基系列
(2).DMEM細胞培養基系列
(3)RPMI-1640細胞培養基系列
(4).199細胞培養基系列
(5).水解乳蛋白細胞培養基
(6)歐氏平衡鹽
(7)F-10,F-12細胞培養基系列
(8)其它類型細胞培養基
4、傳代細胞分散后要經歷的那些階段，什么階段細胞繼代**合適
細胞傳一代后，一般要經過以下三個階段：
1．潛伏期（Latent Phase）。
    細胞貼附于支持物后，除先經過前述延展過程變成極性細胞，還要經過一個潛伏階段，才進入生長和增殖期。細胞處在潛伏期時，可有運動活動，基本無增殖，少見分裂相。細胞潛伏期與細胞接種密度、細胞種類和培養基性質等密切相關。初代培養細胞潛伏期長，約24～96小時或更長，連續細胞系和腫瘤細胞潛伏期短，僅6～24小時；細胞接種密度大時潛伏期短。當細胞分裂相開始出現并逐漸增多時，標志細胞已進入指數增生期。
2．指數增生期（Logarithmic growth Phase）：這是細胞增值**旺盛的階段，只要營養充分，細胞仍然能夠進行增殖分裂，因此細胞數量仍在增多。但當細胞密度進一步增大，培養液中營養成分減少，代謝產物增多時，細胞因營養的枯竭和代謝物的影響，則發生密度抑制（Density Inhibition），導致細胞分裂停止。
3．停滯期（Stagnate Phase）：細胞數量達飽和密度后，細胞遂停止增殖，進入停滯期。此時細胞數量不再增加，故也稱平頂期（Plateau）。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養液中營養漸趨耗盡，代謝產物積累、pH降低。
指數增生期末更適宜細胞繼代
5、簡述細胞計數步驟 
1、將血球計數板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計數板上。
2、將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數板之間。
3、靜置3分鐘。
4、鏡下觀察，計算計數板四大格細胞總數，壓線細胞只計左側和上方的。然后按下式計算：
細胞數/ml＝4大格細胞總數/ 4×10000
注意：鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算，若細胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。
6、簡述細胞污染的種類，及檢測方法
細胞污染種類有細菌，真菌，支原體，外源病毒
細菌和真菌檢測方法
可用TG,GA，GP檢測，
TG渾濁表示污染細菌，GA斜面有白色污染物表示有真菌污染
GP混住表示有真菌污染。
支原體污染的檢測
支原體檢測可用液體培養基和支原體固體培養基，液體培養基變色只能懷疑有支原體污染，移植后仍有同樣顏色變化，或固體培養基出現荷包蛋樣菌落則判斷污染支原體。
    外源病毒檢測
致細胞病變病毒的檢驗
紅細胞吸附病毒的檢驗
特定病毒的檢驗 
     細胞系來源動物的原代細胞；
     對疫苗使用對象動物致病性病毒敏感的細胞；
     對相應病毒敏感的細胞。
     間接免疫熒光試驗 
     PCR試驗
7  細胞傳代要點與注意事項
細胞傳代方法
1、貼壁細胞
（1）洗掉舊培養液；
（2）、用無鈣鎂PBS洗滌細胞一**二次；
（3）、加入適量Trypsin-EDTA溶液
方法一：37℃或溫室作用數分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當細胞將要分離而呈現圓顆粒狀時，洗掉消化液，輕敲培養瓶邊緣使細胞自瓶壁脫落，然后加入適量的新鮮培養液，與脫落的細胞或細胞團塊混合均勻后，依稀釋比例轉移**新的培養瓶中，依正常條件繼續培養之。
 方法二：37℃或室溫作用數分鐘，待細胞自瓶壁脫落后，加入適量含血清的新鮮培養液，以終止trypsin作用，離心后除去上清液，或不作離心處理，添加新鮮培養基后依稀釋比例傳**新的培養瓶中，依正常條件繼續培養之。#p#分頁標題#e#
2、懸浮型細胞
（1）、吸去細胞培養液，放入離心管中，離心1000rpm、5min
（2）、吸除上清液，加入適量的新鮮培養基，與沉淀細胞混合均勻后，依稀釋比例轉移**新的培養瓶中，依正常條件繼續培養。
細胞傳代時注意事項
（1）、紫外消毒過程中會產生臭氧分子，對人體有害。一般情況下，消毒后**少半個小時后再進入。
（2）、所有的實驗器材都要經過消毒處理，所有的細胞操作都在安全柜中進行，每一步都要注意不要用手碰到瓶口，培養液不能碰到瓶口，拿培養瓶時要使培養瓶的瓶口微微翹起。
（3）、細胞消化時間不能太長，要讓細胞盡快脫離不舒服的環境，補加生長液后要保證細胞完全混勻，在顯微鏡下觀察細胞是一個一個的。
（4）、傳代培養時要注意無菌操作并防止細胞之間的交叉污染。所有操作要盡量靠近酒精燈火焰。每次**好只能進行一種細胞的操作。每一種細胞使用一套器材。PBS，培養液和消化液應嚴格分開。
（5）、每天觀察細胞狀態，掌握好細胞是否健康的標準：健康細胞的形態飽滿，折光性好，生長**致密單層后即可傳代。
8   細胞培養目的與用途
 藥物研究與開發 
　　(1) 新藥篩選:如化學合成藥物藥效研究,中藥有效成分篩選與鑒定等.
　　(2) 疫苗研究與開發:如病毒性疫苗的研究與開發(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等),腫瘤疫苗(多肽疫苗)等.
　　(3) 基因工程藥物研究與開發:如干擾素研究與開發,細胞生長因子研究與開發等.
　　(4) 細胞工程藥物研究與開發:生物活性多肽研究與開發,人參皂甙,紫杉醇等生物活性成分研究與開發.
　　(5) 單克隆抗體制備:包括診斷用單克隆抗體,治療用單克隆抗體.
　　基礎研究 
　　(1) 藥物作用機理
　　(2) 基因功能
　　(3) 疾病發生機理
 生物制藥 
　　(1) 疫苗生產:如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等),腫瘤疫苗(多肽疫苗)等.
(2) 基因工程藥物生產:如在臨床醫學中具有治療價值的一些細胞生長因子如干擾素,粒細胞生長因子,胸腺肽等
(3) 診斷用和藥用單克隆抗體生產
(4) 細胞工程藥物生產:生物細胞內的一些生物活性多肽,生物活性物質等
9   無菌操作要求
（1） 手指不能觸及使用端。如觸及，器材需更換或灼燒后再使用
（2） 減少手與器材的接觸面，學會手指操作。
（3） 一切操作，如打開或封閉瓶口，安裝吸管、注射器等，都要在火焰前方進行。使用前需經過火焰消毒后方可使用。
（4） 瓶口順風斜放在支架上，試劑用后立即封閉瓶口。瓶口長時間敞開會增加落菌的機會。
（5） 不同的細胞同時操作時，要專管專用，并要勤換吸管，防止擴大污染和交叉污染。
（6） 瓶口液滴不能倒回瓶內。盡量用酒精棉球擦拭，瓶口再經火焰消毒。
（7） 操作者動作要準確敏捷，盡量避免空氣流動。
10  清洗玻璃器皿（新、舊）
舊的不知如何描述好！待補充！！！
清洗后的玻璃器皿：干凈透明無油跡、不能殘留任何物質
包括浸泡、刷洗、浸酸和沖洗四個步驟
浸泡：初次使用和培養使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶掉
› 新的初次使用的玻璃器皿，在生產及運輸過程中，玻璃表面帶有大量的干固的灰塵，且玻璃表面常呈堿性及帶有一些對細胞有害的物質等
› 先用自來水簡單刷洗，然后用5％稀鹽酸液浸泡過夜，以中和其中的堿性物質
› 再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過的蛋白質，干固后不易洗掉
› 用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上
刷洗：
› 用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿表面附著較牢的雜質
› 刷洗要適度，過度會損害器皿表面光澤度
浸酸：玻璃器皿浸泡到清潔液中
› 清潔液對玻璃器皿無腐蝕作用，而其強氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質
› 浸泡時器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液面
› 浸泡時間：一般為過夜，不應少于6 小時
清潔液 常用三種：重鉻酸鉀（g）濃硫酸（ml）蒸餾水（ml）
›   強清潔液     63∶1000∶200
› 次強清洗液    120∶ 200∶1000
›   弱清潔液    100∶ 100∶1000
配制時應注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護好面部及身體裸露部分。配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產生的熱量揮發，配制溶液應選擇塑料制品。配成后清潔液一般為棕紅色。
11  胰蛋白酶的配制方法
（1） 按照試驗需要稱取酶粉，用少量D-HANKs液將胰蛋白粉調成糊狀。
（2） 加適量D-Hanks液（橙紅色），低速磁力攪拌（室溫和4°間段進行，室溫高于30°時要減少胰酶在室溫下的攪拌時間）直**酶液溶解。
（3） 溶解后的酶液（深紅色），濾過除菌，小瓶分裝，-20°C凍存。#p#分頁標題#e#
12   血清滅活
待補充！！！
血清質量好壞是實驗成敗的關鍵。
血清中含有：
①多種蛋白質（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）②多種金屬離子 ③激素； ④促貼附物質，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長因子⑥轉移蛋白⑦不明成分
常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質量**好。
優質血清的標準：透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒污染。
血清的滅活
(1) 選用與血清瓶同規格的對照瓶一個
(2) 對照瓶內放入魚血清等體積的水
(3) 溫度預試：水浴鍋2-3支體溫計56°
(4) 血清滅活、消除補體活性：56 ℃ ，30 分鐘
(5) 大瓶血清滅活后進行分裝
(6) 分裝后，抽樣做無菌試驗 -20~-70°保存
13  培養細胞的生命期
所謂培養細胞生命期，是指細胞在培養中持續增殖和生長的時間。
1．原代培養期：
也稱初代培養，即從體內取出組織接種培養到**次傳代階段，一般持續1一4周。此期細胞呈活躍的移動，可見細胞分裂，但不旺盛。初代培養細胞與體內原組織在形態結構和功能活動上相似性大。細胞群是異質的，也即各細胞的遺傳性狀互不相同，細胞相互依存性強。如把這種細胞群稀釋分散成單細胞，在軟瓊脂培養基中進行培養時，細胞克隆形成率很低，即細胞獨立生存性差。克隆形成率即細胞群被稀釋分散成單個細胞進行培養時，形成細胞小群（克隆）的百分數。初代培養細胞多呈二倍體核型；由于原代培養細胞和體內細胞性狀相似性大，是檢測藥物很好的實驗對象。
2．傳代期：
初代培養細胞一經傳代后便改稱做細胞系。在全生命期中此期的持續時間**長。在培養條件較好情況下，細胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細胞稱二倍體細胞系。為保持二倍體細胞性質，細胞應在初代培養期或傳代后早期凍存。當前世界上常用細胞均在不出十代內凍存。如不凍存，則需反復傳代以維持細胞的適宜密度，以利于生存。但這樣就有可能導致細胞失掉二倍體性質或發生轉化。一般情況下當傳代10～50次左右，細胞增殖逐漸緩慢，以**完全停止，細胞進入第三期。
3．衰退期：
此期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細胞形態輪廓增強，**后衰退凋亡。在細胞生命期階段，少數情況下，在以上三期任何一點（多發生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細胞可能發生自發轉化。轉化的標志之一是細胞可能獲得永生性或惡性性。細胞永生性也稱不死性，即細胞獲持久性增殖能力，這樣的細胞群體稱無限細胞系，也稱連續細胞系。無限細胞系的形成主要發生在第二期末，或第三期初階段。細胞獲不死性后，核型大多變成異倍體。細胞轉化亦可用人工方法誘發，轉化后的細胞也可能具有惡性性質。細胞永生性和惡性非同一性狀。