1，原代細胞培養
原代培養需要嚴格要求：（1）取材時需要去除脂肪和壞死的組織(2)為減少對組織的損傷，需用鋒利的器具(3)適度離心以去除用于解離的酶（4）由于原代培養組織細胞的存活率很低，故用于原代培養的細胞的密度應高于正常的傳代培養的細胞密度。（5）營養豐富的培養基比單一的培養基更可取，如果要添加血清，胎牛血清比牛馬的血清更好。(6)對于取材部位易于感染（如皮膚）應先用70%乙醇消毒，在無菌條件下切除組織，盡快轉移入BSS或培養基中。不要再培養室取材，因為動物可引入微生物污染。若必須推遲，可保存在4℃，72h。
1.
剪切組織
先將所取得的組織，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手術鑷去除粘附的結締組織等非培養所需組織。再次清洗后，用手術剪將組織剪成若干小塊，移入青霉素小瓶或小燒杯中，加入適量緩沖液，用彎頭眼科剪，反復剪切組織，直到組織成糊狀，約1mm
3大小。靜置片刻后，用吸管吸去上層液體，加入適當的緩沖液再清洗一次。
2.
消化分離
消化分離的目的是將細小的組織塊消化分離成細胞團或分散的單個細胞，以利于進一步的培養，常用的消化酶有胰蛋白酶和膠原酶。
3.
培養
細胞懸液用計數板進行細胞計數，用培養液將細胞數調整為2～5×10
5 cells／m1，或實驗所需密度。分裝于培養瓶中，使細胞懸液的量以覆蓋后略高于培養瓶底部為宜。置CO
2培養箱內，5％CO
2，37℃靜置培養。一般3～5d，原代培養細胞可以粘附于瓶壁，并伸展開始生長，可補加原培養液量1／2的新培養液，繼續培養2～3 d后換液，一般7～14 d可以長滿瓶壁，進行傳代。
注意事項：
1. 無菌操作 細菌或霉菌污染是培養失敗的常見原因，必須加強各個環節的無菌操作觀念，以預防為主，一旦污染，一般是很難消除。
2. 培養液所用的培養液必須滿足細胞生存和生長的必要條件。由于細胞來源的動物種類、組織類型不同，對培養液的要求有一定的差異，必要時可用預實驗的方法選擇適當的培養液。
3. 小牛血清 小牛血清對于維持培養細胞的生存和促進細胞增殖起著關鍵性作用。可選擇多種不同批號的小牛血清進行小樣分析。一旦確定某一廠家的某一批號小牛血清后，就保持應用**實驗完成。
4. 膠原酶溶液 必須新鮮配制，貯存時間過長(即使是-20℃低溫保存)，也將影響消化效力，導致消化時間過長，細胞損傷增加。
5. L—谷氨酰胺 幾乎所有細胞對谷氨酰胺都有較高的要求，細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質，在缺少谷氨酰胺時，細胞會因生長不良而死亡。谷氨酸胺在溶液中很不穩定，加有谷氨酰胺的培養液在4℃冰箱貯存兩周以上時，就應重新加入原來量的谷氨酰胺。
6. 靜置培養 原代細胞在消化分離后，置于CO
2培養箱的頭24-48h (必要時72 h)內，應處于**靜置狀態，切忌不時地取出培養瓶觀察生長狀況，這將使原代分離細胞難以貼壁，更談不上伸展和增殖。這對初學者尤應注意。不必擔心培養液中的營養成份會消耗光，在細胞增殖之前對營養的要求并不大。原代培養初期僅加一薄層培養液的目的也在于有利于細胞貼壁伸展。
7. 消化時間 一般消化**肉眼尚可見微小組織顆粒即可，因為此時組織顆粒已經松散，略經吹打即成細胞團或單個細胞，過久的消化往往導致細胞損傷加重，細胞培養成活率降低。
8. 其它生長因子經過以上處理，一般原代分離細胞培養均可以成功。對于少數特殊類型細胞也可以考慮加一些特殊的生長因子。如胰島素能促使細胞攝取葡萄糖和氨基酸。另外,內毒素、EGF、FGF等均有促有絲分裂作用，但費用較高。
原代外植（組織塊培養）
簡介：組織切碎并清洗，組織塊接種于培養瓶或皮氏培養皿的表面，加入少量含高濃度血清（40%-50%）的培養基，表面張力使標本保持原位，直到他們自發地貼附于表面，隨后細胞開始生長。此方法適合小量組織培養，如皮膚活檢組織，為了盡可能減少細胞損失，而不用酶或機械方法。
操作流程：切割→細切→沉淀清洗→清洗后用吸管轉入培養瓶→傾斜培養瓶吸出平衡鹽溶液→然后加入一薄層培養基→培養2-3w,
無菌材料：培養基（DMEM與F12等體積混合，再加20%胎牛血清）；100ml的DBSS;9cm皮氏平皿，非組織培養級別；尖頭鑷子，尖頭手術刀；100ml廣口移液器；15或20ml離心管；25平方厘米的培養瓶或5厘米的皮氏培養皿，大約100mg組織用5個25平方厘米的培養瓶。開始每瓶放1ml培養基，隨后3-5天每瓶加**5ml.
操作步驟：
1，將組織移入新鮮無菌BSS浸洗
2，移入第2個培養皿切除多余組織，如脂肪或壞死組織，用手術刀交叉切成約1mm
3的小塊。
3，用移液管（先用BSS浸潤，否則組織塊易貼壁）將組織塊移入15或50ml離心管或普通容器中，讓組織塊靜置沉淀。
4，用BSS重懸沖洗組織塊后靜置，去除上清液，重復兩次或更多#p#分頁標題#e#
5，將20-30個組織塊接種在25平方厘米的培養瓶內（記住濕潤移液管）
6，將培養瓶靜置放置一會，待組織塊沉下去，然后稍微傾斜吸出液體，然后以每25平方厘米生長面加入1ml的培養基，緩緩傾斜培養瓶讓組織塊均勻分布于生長面上。
7，蓋上瓶蓋，放到37℃培養箱中18-24h.
8, 如果組織塊已經貼附，則可在未來3-5天內將培養基加**5ml.先預溫，以后每周更換一次，直到細胞已生長
9，外植塊可以自生長中心用鑷子取出，用預先浸洗的移液管移入新的培養器皿中，，然后蓋上蓋子，再繼續培養。
10.更換**瓶的培養基直**細胞生長超過生長面積的一半，此時細胞可以傳代。
總結：此種方法貼壁率很低，但是可用通過一些方法進行改進。如在外植物的上方放一塊蓋玻片，或將外植物置于蓋玻片的邊緣，
2酶的解離消化
組織中細胞與細胞之間的粘附是依靠多種相互作用的同類糖蛋白分子，其中部分粘附分子具有鈣離子依賴性（鈣粘素），故對EDTA較為敏感，螯合素含有鈣離子結合結構域，可結合到細胞外機制中的RDG序列。細胞間基質和基底膜中含有其他糖蛋白對蛋白酶較為敏感；選擇消化液**容易的方法是從單一的消化液入手，過渡**復合的消化液，開始用胰蛋白酶或胰蛋白酶/EDTA的混合物，后加入其他蛋白酶促進消化。由于新生和成年動物細胞經開始分化，纖維結締組織及細胞外基質增多，未分化的增殖細胞減少。對組織進行分離時，損害愈嚴重（長時間的胰酶消化，攪拌），組織越易被破壞成碎片，為了保持**大活性，無論酶的純度如何，應該**大限度的減少胰蛋白酶對細胞的作用時間。當整塊組織在37℃的胰酶中消化時，已分離的細胞應每隔半小時收集一次，胰蛋白酶經離心去除，再以含血清的培養基中和。即可以應用冷消化或溫胰酶消化。
2.1胰酶的溫消化
此技術適應于在相當短的時間消化大的組織尤其是整個小鼠胚胎或雞胚。由于成年組織有大量纖維結締組織，故成年組織不用此法。較敏感的細胞如上皮細胞也不用此法。
無菌材料：組織1-5g,DBSS50ml,用PBSA或正常生理鹽水配制的2.5%粗制胰酶；PBSA 200ml,含血清的生長培養基（DMEM/F12加10%胎牛血清）；培養瓶，每克組織5-10個(根據培養的細胞不同而改變）；9cm皮氏平皿，非組織培養級別；兩個50ml離心管；250ml錐形瓶；磁力攪拌子在試管中高壓消毒；彎頭鑷子，2ml,10ml移液管。
非滅菌材料：
磁力攪拌器，細胞計數板
操作步驟：
1，將組織塊移入加有新配制的無菌DBSS皮氏培養皿中，清洗
2，轉入另一培養皿，切除多余組織如脂肪或壞死組織，用刀切成約3mm
3小塊
3，用彎頭鑷將組織移入15ml或50ml無菌離心管或容器中，讓組織塊沉淀
4，用DBSS清洗組織塊，組織塊沉淀，去除上清液，如此反復2次以上。
5，將組織塊轉入一個空的錐形瓶中，去除多余液體，然后加入180ml的PBSA，
6，加入2.5%的胰酶20ml。以使胰酶**終濃度為0.25%
7, 在錐形瓶中加入攪拌子
8，封住錐形瓶，放到攪拌器上，在37攝氏度溫箱內攪拌
9，每分鐘100r, 30min
10,,30min后，收集解離的細胞: 讓組織塊沉淀； 吸出上清液，置入離心管中，放在冰上，向錐形瓶中加入新的胰酶溶液消化剩余的組織塊，繼續攪拌并孵育 30min; 收集的細胞懸液以500g,5min離心; 用10ml含血清培養基重懸細胞團，儲存于冰浴中。
11，重復第10步的過程直**消化完全為止（大約3-4h)
12, 收集冷的細胞懸液，用血球計數板進行細胞技術，并檢測細胞活性
13，將細胞懸液用培養基稀釋，使每毫升培養基含有1 x 10
6個細胞。接種到培養瓶中，大約每平方厘米為2 x 10
5個細胞。但是對于存活率不明確或難以預知時，細胞計數無價值。此時建議每毫升5-25mg組織的濃度接種。
14，每隔2-4天更換一次培養基（以PH下降為標準）。由于部分細胞粘附較慢甚**易于懸浮生長，所以更換上清液前要先檢查上清液中存活的細胞。
總結;此方法應該把握時間，減少對細胞的損傷。可以通過如下簡單方法來減少細胞的損害：在4℃將組織浸入胰酶，胰酶此時活性很小的條件下浸透組織，然后放在37℃， 在很短時間即可將組織消化。
2.2胰酶的冷消化
無菌材料：培養基（DMEM/F12，含10%胎牛血清）；DBSS; 0.25%粗制胰酶溶于無血清的RPMI1640或MEM/Stirrer salts(S-MEM)中；9cm皮氏平皿，非組織培養級別；直頭，彎頭鑷子；剪刀；25ml螺口錐形瓶；25cm
2、75cm
2培養瓶；2ml,10ml移液器
非滅菌材料：冰浴
操作步驟：
1，將組織移入加有新配制的無菌DBSS的皮氏培養皿中，清洗。
2，轉入另一培養皿中，切除多余組織如脂肪和壞死組織，用手術刀細切成大約3mm#p#分頁標題#e#
3的小塊，對于胚胎器官若小于3mm
3可以全部保留
3，用彎鑷子將組織塊移入15ml或50ml無菌離心管或普通容器中，讓組織塊沉淀
4，用BSS重懸沖洗組織塊，沉淀后去除上清，重復此步驟2次以上
5，去除剩余液體，每克組織加入10ml溶于RPMI1640的0.25%胰酶，置于4℃。
6，在4℃放置6-18h,
7,小心去除胰酶，余下組織及殘余胰酶（若需要此時可以加入1-2ml其他酶）
8,37℃，放置20-30min
9,加入溫培養基，大約每100mg初始組織加1ml，輕輕吹打混合物**組織完全分散開。
10，若部分組織未分散，細胞懸液可以用無菌的平紋紗布或不銹鋼（100-200微米）或falcon 70mm細胞濾器進行過濾細胞。如果有較多的組織時，可在每克組織多加入20ml培養基促進沉淀和隨后的懸液收集，通常2-3min就足以去除大多數的大塊組織。
11，用血球計數板測量并定量細胞密度
12，將細胞懸液用培養基稀釋，使每毫升培養基含有1 x 10
6個細胞，接種培養瓶中同上要求。
13，隔2-4天更換一次培養基（以ph下降為標準）。由于部分細胞粘附較慢甚**易于懸浮生長，所以更換上清液前要先檢測上清液中的存活細胞。
總結：與溫消化相比，冷消化可以獲得較高的細胞存活率，24h生存率。可保留更多的細胞種類。但是不適合大塊組織（大于10g),可以用于小鼠胚胎的上皮細胞，胚鼠的肝臟血細胞培養。
2.3 細胞傳代時，細胞與培養皿的分離
（1）傳代時應檢測細胞活力，活力好的細胞應該密度小，活力差的細胞應該密度高些。
（2）吸出過多的細胞培養基，用不含有鈣離子和鎂離子的平衡鹽溶液或EDTA溶液沖洗細胞。從培養瓶中與細胞生長面相對的一側加入沖洗液，搖晃培養瓶1-2分鐘，沖洗細胞層倒掉沖洗液
（3）按照2-3ml/25cm
2的用量，從培養瓶中與細胞生長面相對的一側加入所選的解離液，確保解離液可覆蓋細胞層，將培養瓶置入37℃條件下培養，輕輕搖晃培養瓶，通常細胞會在5-15分鐘內解離。不同細胞系解離所需的時間可能有所差異。對于難以從基質上分離的細胞系，可通過拍打培養瓶的方式加速細胞分離。
（4）細胞完全分離后，將培養瓶呈直立位放置，使細胞流**培養瓶底部，向培養瓶中加入完全培養基，反復吹打單層細胞表面，使細胞分散。計數細胞并傳代。
要求：對于大多數細胞系或強貼壁性細胞系，用不含鈣離子和鎂離子的PBS進行沖洗，解離液用0.25%的胰蛋白酶或胰酶+EDTA，以不含有鈣鎂離子的平衡鹽溶液進行配制.
2.4原代組織中的細胞解離
（1）shou先無菌采集組織，切除不需要的組織，用無菌手術刀或者剪刀將余下的組織切成2-4mm大小的碎塊。用不含有鈣鎂離子的平衡鹽溶液重新懸浮組織碎塊，進行清洗。待組織塊沉淀后，吸出上清液。反復沖洗2**3次。
（2）將裝有組織塊的容器置于冰上，吸出所有的上清液，加入含有0.25%胰酶，不含鈣離子和鎂離子的平衡鹽溶液（100mg組織加入大約1ml胰蛋白酶溶液。
（3）在4℃下孵育**6-18小時，以便通過**小的胰蛋白酶活性獲得**大的穿透效果。
（4）小心倒掉過量的胰蛋白酶溶液，將組織塊與殘留的胰蛋白酶溶液在37℃條件下共同孵育20-30分鐘。
（5）向組織塊中加入加熱的完全培養基，輕輕吹打，使組織分散。如果使用無血清培養基，則還需要加入大豆胰蛋白酶抑制劑。
（6）用滅菌的紗布或者無菌不銹鋼紗網（100-200μm）過濾細胞懸液，使殘余的組織完全分散，計數并接種細胞。
3細胞傳代培養
傳代
當細胞密度（每平方厘米基質的細胞數）達到鋪滿整個瓶底的有效基質時，或者當細胞濃度（每毫升培養基的細胞數）超出培養基的能力時，細胞生長停止或生長速度大大放緩。這時就需要更頻繁地更換培養基或者進行分瓶培養。
傳代標準：用于判定單層細胞是否需要傳代
（1）細胞密度：正常細胞長**彼此匯合時需要傳代。轉化細胞同樣如此
（2）培養基耗盡：一般ph降低伴隨著細胞密度的增加，這是需要傳代的主要指標。
（3）距上次傳代的時間：常規穿戴**好依照嚴格的時間進行。若到了該傳代的時間細胞還沒有達到足夠高的密度（即細胞沒有彼此匯合），則應增加接種密度；相反，如果細胞很快彼此匯合，則要降低接種密度。從而使在一定的接種密度下細胞的周期性生長將與培養時間和細胞產量相一致。理性的細胞濃度是使細胞每3-4天更換培養基，每7天傳代。
傳代所需無菌材料：
完全生長培養基；以PBS配制的終濃度為0.25%胰酶；培養瓶。
非滅菌材料：
血細胞計數板或電子細胞計數儀
傳代前準備：
1.預熱培養用液：把已經配制好的裝有培養液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內預熱。
2.用75％酒精擦拭經過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。將試劑及材料置于超凈臺上，.正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。#p#分頁標題#e#
3.點燃酒精燈：注意火焰不能太小。
4.準備好將要使用的消毒后的空培養瓶，放入微波爐內高火，8分鐘再次消毒。
5.取出預熱好的培養用液：取出已經預熱好的培養用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內。
6.需要傳代按以下操作
從培養箱內取出細胞：注意取出細胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，仔細檢查培養物有無污染或衰退跡象，根據傳代標準對該培養物進行觀察并決定是否需要傳代，
7.打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時要在酒精燈上燒口消毒，棄去舊培養基，為了避免沖散細胞，沿培養瓶細胞對側加入PBS（0.2ml/cm
2），清洗細胞，去除清洗液，以去除殘留血清。
加胰酶（0.1ml/cm
2）到培養瓶細胞面對側，翻轉培養瓶平放以確保胰酶完全覆蓋細胞層，靜置15-30s,棄去大部分胰酶，只保留少量胰酶，主要不要使單層細胞脫落。使用4℃的胰酶可以防止細胞的成片脫落。
8，平直培養瓶孵育，直**細胞變圓隆起，豎直培養瓶，單層細胞就會從培養瓶表面滑落（通常發生在5-15min之后），注意不要消化過長時間，另一方面也不要在細胞消化好前強制將細胞吹打下來，這樣將導致細胞的成片脫落。
9，加入培養液（0.1-0.2ml/cm
2），用吸管反復吹打單層培養細胞面以分散細胞，**后將吸管的**放于培養瓶底角，上下吹打細胞幾次，注意不要產生氣泡。充分上下吹打以分散細胞使之處于單細胞懸浮狀態。吹打的強度對于各個細胞系有所不同，有的細胞系很容易吹散，而有的則需要大力吹打才能分散。但若吹打力量過大，幾 乎所有的細胞都會受到剪切力的機械損傷。原代或早期幾代培養的細胞由于他們較脆弱和體積較大而尤其容易受到損傷，對于連續細胞系具有較大彈性，需要大力吹打才能完全解離。
10，制備單細胞懸液有助于計算細胞增值率或貼瓶率或進行細胞克隆分離。
11，用血細胞計數板進行細胞計數
12，稀釋懸液到合適的接種濃度。方法一：加入適量細胞懸液到含有已知體積培養基的培養瓶中，此方法適合常規傳代，傳代瓶數不多且不需要準確的細胞計數和細胞增殖能力的檢測。方法二，稀釋細胞**所需的總體積，然后分裝到各個培養瓶中。此方法適用于同時做多個相同的培養，因為操作的次數減少，而且每一培養瓶中細胞密度完全一致。
13，用酒精棉球擦拭培養瓶，適當旋松瓶蓋，放入CO2培養箱中繼續培養。傳代細胞2小時后開始貼附在瓶壁上。當生長細胞鋪展面積占培養瓶底面積25％時為一個＋，占50％為＋＋，占75％時為＋＋＋。蓋上培養瓶蓋，將培養瓶放回孵育箱中，大約1小時后檢查ph的變化，如果培養基在空氣相中ph升高，則要將培養瓶移**無菌區域內，向其中快速（1-2s)吹入5%CO2，如果在5%CO2培養條件下ph還是很高，則可以增加CO2濃度到7%嘗試。但是此方法不可常用，如果問題長存在可以在配置培養基時降低其ph，同時在培養箱中檢查培養基的ph.
注意事項：
1，在任何情況下，主要的細胞分離劑，不論是胰酶還是EDTA，僅做短暫停留，棄去大部分消化液后，僅留少量消化液進行孵育。如果在分離細胞及以后的制備單細胞懸液過程中遇到困難，可采用替代步驟如下。
（1）對于有絲分裂期細胞及其他粘附較松的細胞，可以通過輕微機械振蕩，搖晃，或大力吹打，進行細胞解離
（2）對于不可用蛋白酶的細胞系如受體或細胞表面蛋白分析，以及可造成一些細胞傷害，很難形成單細胞懸液的條件下，利用細胞刮刀進行刮擦。
（3）多數的連續細胞系，在用0.01-0.5%粗胰酶，并經完全去除培養基預處理條件下，可以只用胰酶即可將細胞分離。
（4）某些粘附性強的連續細胞系和很多早期細胞，用0.25%粗胰酶，及PBSA作為培養基預處理后，可以通過清洗+胰酶方法將細胞解離。
2，當把塑料培養瓶放入到培養箱中會因為培養瓶內空氣的膨脹使得較大的培養瓶膨脹而不能放平。可以將培養瓶放入培養箱中30min后快速擰松瓶蓋以減輕壓力，或者可以在蓋緊培養瓶前通過擠壓培養瓶的頂部或底部來解決這問題。
傳代時的細胞濃度
**好的確定方法是以不同的接種濃度接種后作生長曲線，依此選擇出延遲期短，能很快進入對數生長期（倍增時間短），并且下次傳代時可以方便地到達 對數生長期**高點的**小接種濃度。對于新的培養物，可以先以高濃度接種，再逐漸降低接種濃度直**獲得合適的生長周期
而培養物又無衰退表現。
1．吸掉或倒掉培養瓶內舊培養液。
2．向瓶內加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量。以能覆蓋培養
瓶底為宜。
3．置37℃孵箱或室溫（25℃溫度）下進行消化,2～5min后把培養瓶放在倒置顯微鏡下進行觀察,當發現胞質回縮、細胞間隙增大后，應立即中止消化。
4．吸出消化液，向瓶內加入Hanks液少量，輕輕轉動培養瓶，把殘留消化液沖掉，然后再加培養液。如果僅使用胰蛋白酶消化,在吸除胰蛋白液后,可直接加入少量含血清的培養液,終止消化。#p#分頁標題#e#
5．使用彎頭吸管，吸取瓶內培養液，按順序反復輕輕吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。吹打時動作要輕柔，以防用力過猛損傷細胞。
6．用計數板計數后，分別接種于新的培養瓶中，置CO
2培養箱中進行培養。
7．細胞培養換液時間應根據細胞生長的狀態和實驗要求來確定。一般2～3天后應換一次生長液。待細胞鋪滿瓶皿底面，即可使用。也可繼續傳代擴大培養或換成維持液。
注意事項：
1. 掌握好細胞消化的時間，消化時間過短時，細胞不宜從瓶壁脫落，過長的消化會導致細胞脫落、損傷。
2. 掌握好消化濃度，當消化液濃度過高時，消化時間應縮短，過低時細胞消化時間相對延長。
4細胞的凍存及復蘇
細胞低溫凍存是培養室常規工作和通用技術。細胞再次長到覆蓋率80-90%左右，將其消化后，常規凍存（凍存液要現配）。細胞凍存在-196℃液氮中，儲存時間幾乎是無限的，若細胞凍存在-152℃，保存期為一年，一年內需復蘇重新凍存，凍存復蘇的原則是慢凍快融。
1．凍存細胞
（1）選對數增生期細胞(證明無支原體污染)，在凍存前1d換液。
（2）按常規方法把培養細胞制備成懸液，計數，使細胞密度達5×10
6／m1左右密度，離心，去上清。
（3）加入配制好的凍存液（培養液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml，5.6%NaHCO
3 0.1ml），按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中,然后用吸管輕輕吹打令細胞重懸。凍存細胞時培養液中加入保護劑10％二甲基亞砜(DMSO) 或甘油，可使冰點降低，使細胞內水分在凍結前透出細胞外。
（4）分裝于無菌凍存管中，每管加1.5m1懸液。
（5）旋好凍存管并仔細檢查，一定要蓋緊，作好標記。
（6）凍存：在特殊的儀器或簡易的液氮容器中，按-1℃／min的速度,在30～40 min時間內,下降到液氮表面，再停30 min后，直接投入液氮中。要適當掌握下降冷凍速度，過快能影響細胞內水分透出，太慢則促進冰晶形成。或將細胞凍存于-152℃冰箱。
操作時應戴防護眼鏡和手套，以免凍傷。
2. 復蘇細胞
細胞復蘇的原則－快速融化：必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化**37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。
(1) 實驗前準備：
1.將水浴鍋預熱**37℃
2.用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面。
3.在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養瓶等等。(2)．取出凍存管：
1.根據細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號的凍存管。
2.從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。(3)．迅速解凍：
1.迅速將凍存管投入到已經預熱的36-37℃水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化，30～60s內完成。
2.約1-2min后凍存管內液體完全溶解，取出用70%酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內,打開蓋子,用吸管將細胞懸液注入離心管中,再滴加10 m1培養液。
(4)平衡離心：
用架盤天平平衡后，放入
離心機中3000r/min 離心3min或者低速離心(500～1000r／min) 5 min，去上清后再用培養液洗一次。
(5)制備細胞懸液：
1.吸棄上清液。
2.向離心管內加入10ml培養液，吹打制成細胞懸液。
(6)細胞計數：
細胞濃度以5×105/ml為宜。
(7)培養細胞
將復合細胞計數要求的細胞懸液分裝入培養瓶內，將培養瓶放入37℃和5％CO2的培養箱內2-4小時(或者24-48小時)后換液繼續培養培養，換液的時間由細胞情況而定。
初學者易犯錯誤：
1水浴鍋未預熱或者未預熱到37℃。
2.水浴鍋內凍存管太多，導致傳熱不佳，使融化時間延長。
3.離心前忘記平衡，導致
離心機損壞和細胞丟失。
4.一次復蘇細胞過多，忘記更換吸頭和吸管，導致細胞交叉污染。
5，凍存細胞數量要充分，密度應達到10
7／m1，在融后稀釋20倍后，仍能保持5×10
5個／m1數量。
5
， 細胞計數
實驗原理：當待測細胞懸液中細胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細胞的數目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數目。具體操作：
(1)準備工作：
取一瓶傳代的細胞，按照《傳代細胞培養(消化法)》中的傳代方法繁殖細胞，待長成單層后以被使用。
(2)細胞懸液制備：
細胞懸液的制備方法是用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后，加入培養液(或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液)，吹打制成待測細胞懸液。
(3)細胞計數：
1.蓋好蓋玻片：取一套血球計數板，將特制的蓋玻片蓋在血球計數槽上。
2.制備計數用的細胞懸液：用吸管吸5滴細胞懸液到一離心管中，加入5滴臺盼藍染液(0.4％)或苯胺黑，活細胞不會被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區別活細胞和死細胞。
3.將細胞懸液滴入計數板：將待測細胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。
4.統計四個大格的細胞數：將血球計數板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數板，當看到鏡中出現計數方格后，數出四角的四個大鉻(每個大格含有16個中鉻)中沒有被染液染上色的細胞數目。#p#分頁標題#e#
5.計算原細胞懸液的細胞數:按照下面公式計算細胞密度：
(細胞懸液的細胞數)/ml＝ ( 四個大格子細胞數/4) ×2×104
說明：公式中除以4因為計數了4個大格的細胞數。
公式中乘以2因為細胞懸液于染液是1：1稀釋。
公式中乘以104因為計數板中每一個大格的體積為：
1.0mm(長)×1.0mm(寬)×0.1mm(高)＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3
(4)細胞計數要點：
1.進行細胞計數時，要求懸液中細胞數目不低于104個/ml，如果細胞數目很少要進行離心再懸浮于少量培養液中；
2.要求細胞懸液中的細胞分散良好，否則影響計數準確性。
3.取樣計數前，應充分混勻細胞懸液，尤其時多次取樣計數時更要注意每次取樣都要混勻，以求計數準確；
4. 數細胞的原則是只數完整的細胞，若細胞聚集成團時，只按照一個細胞計算。如果細胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計右線，不計左線。
5. *作時，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數。
(5)初學者易犯的錯誤：
1. 計數前未將待測懸液吹打均勻。
2. 滴入細胞懸液時蓋玻片下出現氣泡。
3. 滴入懸液時的量太多，**使細胞懸液流入旁邊的槽中。
本實驗特殊試劑的配制：
4％臺盼藍母液：稱取4克臺盼藍，加入少量蒸餾水研磨，加雙蒸水**100毫升，用濾紙過濾，4℃保存。
使用液：使用時，用PBS稀釋母液**0.4％即可。
6用濾膜濾器過濾液體除菌
1、將濾膜放入去離子雙蒸水中浸泡。用鑷子取出濾膜，裝入小濾器中，扭緊后再松開一圈（不銹鋼濾器螺絲不要擰太緊）。高壓蒸氣滅菌，其后自然干燥。
2、使用前先擰緊小濾器，10ml注射器接上小濾器上口，加入2ml待濾液體，推上針芯，并保留數毫升氣體。推壓針芯，液體濾盡后，繼續適當用力推壓，針芯有彈性并不能將氣體推盡，則表明此濾器濾膜是安裝完好的。
3、正式過濾待濾液體。濾完后再次推空氣，如有阻力，表明過濾過程中濾膜保持完好。打開小濾器，再次檢查濾膜是否完好。如果發現濾膜破損，應重新過濾。
注：
1．小濾膜器使用方便，適于少量液體過濾（也可選用一次性濾器）；
2．有些有機物質（如DMSO）可溶解濾膜，因而不能使用；
3．市場上有成品出售，可直接應用，但仍應在過濾前后用推注氣體的方法檢測濾膜是否完好；一些大分子蛋白質可以粘在濾膜上，損失很大，可以先用少量血清或蛋白質沖洗一下濾膜，可減少這種損失。
7，ph 對溶液的關系
酚紅，在ph7.4時，呈紅色；ph 7.0，呈橘紅絲；ph 6.5呈黃色；低于6.5為檸檬黃；ph7.6,呈桃紅色；ph7.8紫紅色。由于顏色的判斷具有較高的主觀性，因此制作一個標準色階很必要
ph標準色階的制備
材料：Hank's平衡鹽溶液（HBSS)，10倍濃縮液或粉劑，不含碳酸鹽或葡萄糖，含有20mmol/l HEPES
9個瓶子（大小與**長使用的培養基或培養瓶相似），超純水，
滅菌的0.1mol/l 氫氧化鈉（用超純水配制，過濾除菌）
操作步驟：
1，配制ph6.5的BSS，分裝**7個大小適宜的瓶子中。
2，使之與空氣達到平衡
3，用無菌的0.1mol/l氫氧化鈉調節ph**6.8,7.0,7.2,7.4,7.6,7.8以ph計測定。
4，將調節好的BSS過濾除菌，然后存放于培養瓶中
5，保持無菌和密封。
10，培養基的更換
需要更換的四個指標：
（1）PH，當ph從7.0降到6.5時大多數細胞就停止生長；當ph在6.5和6.0之間時細胞開始失去活性。如果培養基從紅色變成橙色，再變成黃色，那么就需要更換培養基了。可以通過顏色變化估計ph變化率，如果ph為7.0的培養物每天降低0.1ph單位，那么在換液前多放置一兩天沒什么關系，但若培養物每天降低0.4ph單位，那么需要在24-48h內換液。
（2）細胞密度
（3）細胞類型：正常細胞如二倍體成纖維細胞在高密度時停止分裂，此時細胞停滯在細胞周期的G1期，根據情況換液。
（4）形態衰退，通過長期定期觀察形成經驗來判斷。
培養細胞時，培養基的體積與表面積比通常為0.2-0.5ml/cm
2，其**適比例是由該細胞的需氧量決定，需氧量高的細胞在較淺的培養基中生長較好（如2mm），需氧量較低的細胞在較深的培養基中生長較好（如5mm）
更換培養基的無菌材料：
移液管，培養基
操作步驟：
（1）準備好超凈工作臺，以70%乙醇浸泡的紗布擦拭超凈工作臺及實驗所需的試劑及材料，并將擦拭過的試劑及材料立即放到超凈工作臺。
（2）仔細觀察培養物是否有污染或衰退跡象。
（3）考察上述判別是否需要更換培養基的標準，即ph和細胞密度或濃度，如果需要則按下不操作。#p#分頁標題#e#
(4)將培養物放于無菌工作區域
（5）吸除舊培養基
（6）加入同體積的新鮮培養基。**好將培養基預熱**37攝氏度。
（7）將培養物重新放回培養箱
注意：當培養物密度過低或生長緩慢時**好進行半量換液，即在第5步僅僅吸出一半舊培養基，在第6步補入相同體積的新鮮培養基。
即使是高密度的細胞群體，更換培養基也會刺激細胞進行有絲分裂，因此當不需要有絲分裂時可使用維持培養基。維持培養基是血清濃度降**0.5%-2%或完全不加血清的常規培養基。
12，GIEMSA染色
GIMSA是一種多色的血涂片染料，進行血圖片染色時，常與May-Grunwald染液結合使用，但不用于細胞的染色。染色后核呈粉紅或紫羅蘭色，核仁呈藍黑色，細胞質呈淺灰藍色。所染細胞必須乙醇或甲醇固定，制備過程中必須徹底脫水，否則不能正常染色。
非滅菌材料：
PBSA; PBSA：甲醇（1:1）；未稀釋的GIEMSA染液；甲醇；去離子水
操作步驟：
1，吸去培養基
2，用PBSA沖洗單層細胞，去掉沖洗液
3，加入PBSA/甲醇液0.2ml/cm
2，靜置2min,然后去掉PBSA/甲醇液
4，加新甲醇5ml,靜置10min.
5, 棄掉甲醇液，用無水甲醇，沖洗單層細胞，去掉甲醇。
6，此時，培養瓶經干燥可儲存，也可直接進行染色。即使是干的培養瓶，用新配的無水甲醇沖洗后直接染色時非常重要的。如果甲醇倒出，培養瓶靜置了一段時間后，殘留的甲醇會吸收水分，從而妨礙下一步的染色。
7，加入純度GIEMSA染液，0,。08ml/cm
2,確保覆蓋整層細胞。
8,2min后，用8ml水稀釋染液，并輕輕晃動2min.
9,用水置換染液，游走浮渣，用自來水沖洗細胞，直到去除片狀粉色本底（沉積），
10，將水倒掉，用去離子水沖洗，在單層細胞仍處于濕潤狀態時，用顯微鏡觀察細胞，干燥，保存染色，觀察時應重新使它濕潤。
13，結晶紫染色
非滅菌材料：
PBSA;PBSA/甲醇（1:1）； 甲醇；結晶紫；過濾漏斗和濾紙，大小適合于每個培養皿中盛載5ml的染液；回收染液的瓶子。
操作步驟：
1，吸去培養基
2，用PBSA沖洗單層細胞，棄掉沖洗液
3，每25cm
2加入PBSA/甲醇 5ml,靜置2min,棄掉PBSA/甲醇
4，加入新甲醇5ml, 靜置10min
5,棄掉甲醇，將培養皿中的液體倒干凈，使其干燥
6，每25cm
2加入5ml結晶紫，靜置10min.
7,過濾漏斗放置在瓶上
8，將染液倒入漏斗
9，用自來水沖洗培養皿，然后用去離子水沖洗，干燥培養皿。
14，涂片制備
無菌材料：用50%-100%血清懸浮的濃縮細胞懸液；血清
非無菌材料：顯微鏡載玻片；甲醇；電扇
操作步驟：
1，在載玻片一端滴一滴血清，用第二張載玻片末端蘸取這滴血清，并在**張載玻片上移動，在玻片表面形成一薄層血清。
2，用電扇使血清干燥
3，用50%-100%血清懸浮細胞，細胞濃度為10
6/ml,取一滴血清滴在載玻片一端，用第二張載玻片末端蘸取這滴細胞懸液，在**張載玻片上移動，形成一薄層細胞的分布
4，迅速干燥載玻片，甲醇固定。
15
,染色體制備
固定阻滯在M期的細胞，在低滲培養基中會發生膨脹，將細胞滴在載玻片上，染色，觀察
無菌材料：
對數期的培養細胞；用PBSA配制的10
-5mol/l 秋水仙胺；PBSA;0.25%的粗提胰蛋白酶
非滅菌材料：
低滲溶液：0.04mol/l KCL; 0.025mol/l 枸櫞酸鈉；醋酸甲醇固定液；一份冰醋酸加三份無水甲醇或乙醇，新鮮配制并在冰上保存；Giemsa染液；DPx或permount 封固劑；冰；離心管；巴斯德吸管；載玻片；蓋玻片#00；載玻片盒；低速
離心機；渦流混懸器。
操作步驟:
1,將細胞濃度為2 x 10
4 ** 5 x 10
4/ml的培養液20ml放入75cm
2的培養瓶（每平方厘米4 x 10
3**1 x10
4個細胞）中培養。
2，約3-5天后，細胞處于對數生長期，以1：100（v:v)加入1 x10
-5mol/l秋水仙胺（終濃度1 x 10
-7）于培養瓶內已有的培養基中。
3,4-6h后，輕輕去掉培養基，加5ml 0.25% 胰蛋白酶，孵育10min.#p#分頁標題#e#
4,胰蛋白酶西鄰懸浮細胞，棄掉上清液中胰蛋白酶。
5，以5ml低滲溶液重新混懸細胞，37℃，靜置20min.
6,加入等量新鮮配制的冰冷的醋酸甲醇，不停地混合，然后以100g速度離心2min
7,棄掉上清混合物，在渦流混懸器上振蕩細胞團塊，再慢慢邊混勻邊加新制備的醋酸甲醇。
8，細胞在冰上靜置10min.以100g速度離心細胞2min.
9,棄掉上清中的醋酸甲醇，在0.2ml的醋酸甲醇溶液中重新振蕩以混懸細胞團（例如，將試管底部置于振蕩器上），直到細胞均勻分散。
10，用吸管吸一滴細胞懸液到吸管尖部，從30cm處滴到涼的玻片上，傾斜玻片，讓流滴流下并鋪開。
11，將玻片在燒杯的沸水上迅速干燥，然后用相差顯微鏡觀察。如果細胞均勻鋪展而沒有相互接觸，則以同樣濃度的細胞制備更多片子。如果細胞成堆重疊出現，則稀釋懸液2-4倍之后，再準備一張滴液玻片。
12，進行Giemsa細胞染色：
將玻片浸入純凈的染液中2min; 將染色缸放在水池中，加入大約10倍體積的水，讓過多的染液從玻片染色缸的頂端溢出；玻片靜置2min;用自來水置換出其余染液，然后用自來水逐張沖洗玻片去除染液沉淀（使玻片上呈現粉紅色，不透明的外觀）；顯微鏡下觀察染色情況，對于滿意的則將載玻片徹底干燥，用#00蓋玻片及DPX或Permount封片。
16，清潔培養箱
非滅菌材料
水中含有2%新吉爾滅或類似的真菌抑制劑，將上述水溶液注入水盤中；替代的CO2溫箱或塑料盒和封口的膠帶；去污劑（10%新吉爾滅或另一種滅菌去污劑，70%乙醇）
操作步驟：
1，將全部培養物移**另一個二氧化碳溫箱；或包裝培養物，并通CO2，然后將其放置在普通培養基或溫室中。
2，將準備清潔的溫箱斷開電源
3，將溫箱中所有的隔板及水盤和可拆卸的部件取出
4，用含有去污劑的溶液清洗溫箱內部，盡可能擦抹每個角落及縫隙處
5，用清水沖洗
6，用70%乙醇擦洗溫箱內部
7，在保持門打開的狀態下，加熱（不是加CO2）直**溫箱干燥。
8，用去污劑擦洗隔板及各部件，然后用清水沖洗，用70%乙醇擦洗
9，將隔板及各種部件放回溫箱中
10，放回水盤，注入含有2%新吉爾滅的水
11，關門和接通CO2氣體
12，當溫度和CO2已趨于穩定，將培養物放回溫箱。
17細胞培養的疑難解析
1，
培養基的ph值變化迅速：
（1） CO2分壓設置錯誤：應根據培養基中碳酸氫鈉的濃度降低或升高培養箱中CO2分壓，當碳酸氫鈉的濃度在2.0-3.7g/l，應相應的使用5%**10%的二氧化碳分壓。
（2） 組織培養瓶蓋的過緊：應將蓋子懸松1/4圈。
（3） 碳酸氫鹽的緩沖能力不足：應加入HEPES緩沖液，使其**
終濃度為10-25mM
(4) 細菌、酵母或真菌污染
2， 細胞無法在培養器皿上貼壁
（1） 胰蛋白酶消化過度：應縮短胰蛋白酶的消化時間，或者減少用量
（2） 支原體污染：隔離培養物，檢測其是否感染支原體，清除通風櫥和培養箱。
(3) 培養基中無附著因子。
3， 懸浮細胞聚集在一起：
（1） 存在鈣離子和鎂離子：用不含鈣離子和鎂離子的平衡鹽溶液沖洗細胞。輕輕吹打細胞，使其形成單細胞懸液。
（2） 支原體污染：隔離培養物，檢測其是否感染支原體。清除通風櫥和培養箱。如果培養物被污染，則丟棄。
（3） 蛋白酶消化過度，細胞裂解釋放DNA.
4， 原代細胞培養被污染;
(1) 殘留的原代組織將培養物污染：培養前，用含有較高濃度抗生素和抗真菌劑的平衡鹽溶液清洗組織碎片數次。
5， 培養物生長緩慢：
（1） 培養基或血清改變：比較不同培養基配方中葡萄糖和氨基酸及其他成分有無差異；通過生長實驗比較新老批次血清有無差異；增大細胞初始接種密度。
（2） 必需生長促進成分（如：L-谷氨酰胺或生長因子）耗竭，缺乏或分解：去除原培養基加入新培養基。
（3） 輕度細菌或真菌污染：在不加抗生素的條件下進行培養，如果污染物被污染，則丟棄。
（4） 試劑儲存不當：血清應在-5℃**-20℃下儲存。完全培養基應在2℃到8℃下避光儲存，**長可使用兩周。盡量減少血清和培養基見光時間。
（5） 細胞初始接種密度過低。或有限培養物衰老。
（6） 支原體污染。
6， 培養物死亡
（1） 培養箱中無二氧化碳：檢測培養箱中二氧化碳使用速度，以便確定何時更換氣瓶。經常檢查管路連接處是否漏氣，不要頻繁開啟培養箱門。
（2） 培養箱中溫度有波動。
（3） 抗生素濃度過大，培養基的滲透壓不合適。
7， 細胞污染應對：#p#分頁標題#e#
§ 培養細胞一經污染，多數較難處理。如果污染細胞價值不大，宜棄之；在尋找原因后徹底消毒操作室，復蘇或重新購置細胞，再培養。
§若污染細胞價值較大，又難于重新得到，可采取以下辦法清除。
一、細菌和真菌的清除
§1、使用抗生素
§抗生素對殺滅細菌較有效。聯合用藥比單獨用藥效果好。預防用藥比污染后再用藥效果好。
§預防用藥一般用雙抗生素，污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗法，于加藥后作用24～48小時，再換常規培養液。此法在污染早期有效。
（二）、支原體的清除
§１、用MRA處理
§用MRA（Mycoplasma Removal Agent）處理細胞，每4天換一次液,連續處理15天以確保細胞純潔健康．效果好．
§2、用清洗純化法清除支原體污染的方法
§細胞營養馴化→優質細胞群的篩選→細胞清洗→反復離心洗滌 ，其原理是利用離心力、細胞、微生物質量和懸液的浮力差達到清除支原體的目的。由于支原體個體小且除發酵支原體外多為細胞外寄生,所以通過反復洗滌細胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數量降低**極限. §如結合敏感抗生素的抑殺作用，可達到更好的效果。
§3、藥物輔助加溫處理
§先用藥物處理后，再將污染的組織培養物放在41℃培養18小時，可殺死支原體，但對細胞有不良影響。
４、使用支原體特異性血清
§用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長，故經抗血清處理后11天即轉為陰性，并且5個月后仍為陰性。 但此法比較麻煩，不如用抗生素方便、經濟。
（四）、污染的預防
§預防是防止細胞培養過程中發生污染的**好辦法。只有預防工作做在前，才能將發生污染的可能性降到**小程度。
§一般預防可從以下幾方面著手：
1、添加抗生素
2、從物品、用品消毒滅菌著手
§細胞培養所用物品清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細，并在無菌試驗陰性后才能使用。 操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌。
3、從操作者做起
§（1）進無菌室前要用肥皂洗手，按規定穿隔離衣。工作開始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。
§（2）操作者動作要輕，必須在火焰周圍無菌區內打開瓶口，并將瓶口轉動燒灼。操作時盡量不要談話，若打噴嚏或咳嗽應轉向背面。
§（3）操作時要常更換吸管，一旦發現吸管口接觸了手和其他污染物品應棄去。實驗完畢用消毒水浸泡的紗布擦臺面。
4、防止細胞交叉污染
§在進行多種細胞培養操作時，所用器具要嚴格區分。
§在進行換液或傳代操作時，注射器和滴管不要觸及細胞培養瓶瓶口，以免把細胞帶到培養液中污染其他細胞。
§細胞一旦購置或從別處引入，均應及早留種凍存，一旦發生污染可重新復蘇培養。
５、無菌室的徹底消毒
§1) 0.1%新潔爾滅全面徹底擦洗無菌室；
§2）甲醛熏蒸法：甲醛是一種廣譜滅菌劑菌，其水溶液和氣休對各種細菌、芽孢及真菌等微生物均有殺滅作用。
Invitrogen細胞培養污染策略：
1， 如果無法替換的培養物受到污染，研究人員可以嘗試消除或控制污染。shou先應確定污染物是細菌，真菌，支原體或是酵母。將受污染的培養物與其他細胞系隔離，使用實驗室消毒劑清洗培養箱和層流通風處。并檢查HEPA濾器。
2， 高濃度的抗生素和抗真菌劑會對一些細胞系產生毒性，因此應進行劑量效應試驗，確定抗生素或抗真菌劑產生你毒性的劑量水平。以下為建議操作程序：
（1），解離和計數細胞，用無抗生素培養基稀釋細胞。漿細胞稀釋到常規細胞傳代用的濃度。將細胞懸液移入多孔培養板或者數只小培養瓶中。將所選的抗生素以一系列的濃度分別加入各個孔或培養瓶中。
（2）每天觀察細胞是否出現中毒征象如脫落，出現空泡，融合度降低和細胞變圓。
（3）確定抗生素的毒性水平后，以此濃度的三分之一或二分之一為抗生素使用濃度，進行2到3代的細胞培養。
(4)將細胞在無抗生素的培養基中培養一代，重復第三步，
(5)將細胞在無抗生素培養基中培養4**6代，以確定污染是否已經消除。
3，抗生素建議使用的濃度如下：
Fungizone(兩性霉素B) 0.25-2.5μg/ml, 針對于真菌及酵母37℃培養基中可以維持3天穩定性。
硫酸慶大霉素 5-50μg/ml G+,G- 支原體 穩定5天
硫酸卡那霉素 100μg/ml G+, G-,支原體 5天穩定
青霉素 50-100單位/ml G+ 3天穩定#p#分頁標題#e#
硫酸鏈霉素 50-100μg/ml G+,G- 3天穩定
