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傳代細(xì)胞培養(yǎng)與病毒在傳代細(xì)胞中的培養(yǎng)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
了解倒置顯微鏡的構(gòu)造與使用,了解不同傳代細(xì)胞的形態(tài)及接毒后的病變特征,掌握細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方法、病毒接種方法及收毒方法。
二、常用細(xì)胞的種類
BHK-21:倉(cāng)鼠腎傳代細(xì)胞
PK-15:豬腎傳代細(xì)胞
IBRS-2:豬腎傳代細(xì)胞
Hela:人的子宮瘤細(xì)胞
Vero:非洲綠猴腎細(xì)胞
Marc-145:來(lái)源于Vero細(xì)胞
TK-143:人的胸苷激酶陰性細(xì)胞
Sf9:昆蟲(chóng)細(xì)胞  
三、材料
1、100ml細(xì)胞瓶、吸管、吸球、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、加樣器、槍頭
2、BHK-21(baby hamster kidney)細(xì)胞
3、0.25%胰酶
4、生長(zhǎng)液:含10%犢牛血清、200U/ml青、鏈霉素的DMEM
  維持液:含2-5%犢牛血清、200U/ml青、鏈霉素的DMEM
5、偽狂犬病病毒液(PRV)
四、傳代細(xì)胞培養(yǎng)的條件要求
1)細(xì)胞密度:2-3×105個(gè)/ml
2)pH范圍   **適pH7.0-7.4,耐受pH6.6-7.8
3)培養(yǎng)溫度
   哺乳動(dòng)物細(xì)胞一般為37℃
   昆蟲(chóng)細(xì)胞28-30℃
五、常用細(xì)胞分散劑與作用原理
1、胰酶  使精氨酸或賴氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之間的多肽鏈發(fā)生水解,導(dǎo)致細(xì)胞間質(zhì)水解而使細(xì)胞或組織塊消化為分散的單個(gè)細(xì)胞。
2、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA):與二價(jià)鈣、鎂離子結(jié)合,從而使細(xì)胞分散。
3、灰色鏈絲菌酶 :由灰色鏈絲菌提取的一種酶制劑,是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。
六、營(yíng)養(yǎng)液
1、人工綜合營(yíng)養(yǎng)液
氨基酸、糖類、無(wú)機(jī)鹽類、維生素、輔酶、嘌呤、嘧啶、輔助生長(zhǎng)因子。
2、血清
1)血清的種類
    胎牛血清、新生犢牛血清、成年牛血清、馬血清、雞血清、兔血清、羊血清、人血清,其中以新生犢牛血清使用**為廣泛。
2)血清的處理
無(wú)菌采集,過(guò)濾除菌。用前56℃滅活30min。
3)血清的作用
A、能提供細(xì)胞生存、生長(zhǎng)和增生所必須的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子。
B、能補(bǔ)充基礎(chǔ)培養(yǎng)液中沒(méi)有或量不足的營(yíng)養(yǎng)成分。
C、含有一些可供貼壁依賴型細(xì)胞在培養(yǎng)器皿表面貼附和鋪展的生長(zhǎng)基質(zhì)成分。
D、有中和毒性物質(zhì)保護(hù)細(xì)胞不受傷害的作用。
E、給培養(yǎng)液提供良好的緩沖系統(tǒng)。
F、提供蛋白酶抑制劑,保護(hù)細(xì)胞免受細(xì)胞釋放的蛋白酶的損害。
4)應(yīng)用血清存在的問(wèn)題
A、血清中存在不少有害于細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的物質(zhì):補(bǔ)體、免疫球蛋白、生長(zhǎng)抑制因子。
B、血清的成分不明確,影響對(duì)結(jié)果的分析。
C、不同動(dòng)物、不同批次的血清成分和活性差別較大,使得培養(yǎng)結(jié)果不穩(wěn)定。
七、傳代細(xì)胞系培養(yǎng)
1、優(yōu)點(diǎn):1) 可以無(wú)限的傳代。
2) 不少細(xì)胞系對(duì)病毒很敏感。
3) 某些傳代細(xì)胞系能在懸浮培養(yǎng)條件下培養(yǎng),適合病毒抗原的大量生產(chǎn)。
4) 生長(zhǎng)旺盛,繁殖快速,對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件不苛刻。
缺點(diǎn):在傳代過(guò)程中遭到支原體和病毒的污染。
培養(yǎng)方法
1)取長(zhǎng)滿單層的細(xì)胞一瓶,傾去培養(yǎng)液。
2)加入2ml 胰酶消化液,于37℃培養(yǎng)箱放置幾分鐘,**細(xì)胞間出現(xiàn)空隙或細(xì)胞變圓后,倒去消化液。
3)加入生長(zhǎng)液,反復(fù)吹打幾次,使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞,然后分裝于3個(gè)小瓶中。再在每個(gè)小瓶中補(bǔ)充生長(zhǎng)液**10ml,然后置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),培養(yǎng)1-2天即可長(zhǎng)成單層。
八、病毒(PRV)在傳代細(xì)胞中的培養(yǎng)
1、選長(zhǎng)滿單層的細(xì)胞,倒掉培養(yǎng)液。
2、加入適量的病毒懸液
3、置溫箱中感作(吸附)45min-1h。
4、取出瓶子,倒掉或不倒掉培養(yǎng)液,補(bǔ)足維持液,置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng),直**80%以上的細(xì)胞病變。
5、收毒:將病變的細(xì)胞置于-20℃冰箱中,凍結(jié)后取出自然解凍,在解凍過(guò)程中振搖幾次,以使細(xì)胞完全從瓶壁上脫落。然后將病毒液收集于鹽水瓶或其它容器中。低溫貯藏備用。
 
實(shí)驗(yàn)四  病毒感染力的滴定(TCID50的測(cè)定)
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
    了解病毒感染力測(cè)定的幾種常用方法,掌握半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量TCID50的操作步驟、計(jì)算方法及含義。
二、測(cè)定病毒感染力的方法
半數(shù)致死量LD50( 50% lethal dose):用動(dòng)物或雞胚來(lái)檢測(cè)
半數(shù)雞胚感染量EID50(egg 50% infective dose):用雞胚來(lái)檢測(cè)
半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量TCID50(50% tissue culture infective dose):用細(xì)胞來(lái)檢測(cè)
蝕斑形成單位(plaque forming unit,PFU):用細(xì)胞來(lái)檢測(cè)
三、材料
1、長(zhǎng)滿單層的細(xì)胞1瓶
2、胰酶、吸球、吸管、生長(zhǎng)液
3、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板
4、加樣器、槍頭
5、病毒液(PRV)
四、TCID50的操作步驟
1、在青霉素瓶或離心管中將病毒液作連續(xù)10倍的稀釋,從10-1-10-10
2、將稀釋好的病毒接種到96孔微量培養(yǎng)板中,每一稀釋度接種一縱排共8 孔,每孔接種100µl。
3、在每孔加入細(xì)胞懸液100µl,使細(xì)胞量達(dá)到2~3×105個(gè)/ml。
4、設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照,正常細(xì)胞對(duì)照作兩縱排。(100µl生長(zhǎng)液+100µl細(xì)胞懸液)#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
5、逐日觀察并記錄結(jié)果,一般需要觀察5-7天。
6、結(jié)果的計(jì)算,按Reed-Muench兩氏法或Karber法
五、TCID50的計(jì)算方法
1、Reed-Muench兩氏法
病毒液稀釋度 出現(xiàn)CPE孔數(shù) 無(wú)CPE孔數(shù) 累    計(jì) 出現(xiàn)CPE孔所占的%
CPE孔數(shù) 無(wú)CPE孔數(shù)
10-1 8 0 27 0 100(27/27)
10-2 8 0 19 0 100(19/19)
10-3 7 1 11 1 91.6 (11/12)
10-4 3 5 4 6 40(4/10)
10-5 1 7 1 13 0.7(1/14)
10-6 0 8 0 21 0(0/21)
CPE:Cytopathic effect
距離比例=(高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)-50%)/(高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)-低于50%病變率的百分?jǐn)?shù))
        =(91.6-50)/(91.6-40)
       = 0.8
lgTCID50=距離比例×稀釋度對(duì)數(shù)之間的差+高于50%病變率的稀釋度的對(duì)數(shù)
       =0.8×(-1)+(-3)
       =-3.8
TCID50=10-3.8/0.1ml
含義:將該病毒稀釋103.8接種100µl可使50%的細(xì)胞發(fā)生病變。
2、Karber法
病毒液稀釋度 出現(xiàn)CPE的孔數(shù) 出現(xiàn)CPE孔的比率
10-1 8 8/8=1
10-2 8 8/8=1
10-3 7 7/8=0.875
10-4 3 3/8=0.375
10-5 1 1/8=0.125
10-6 0     0/8=0
 
lgTCID50=L-d(s-0.5)
L:**高稀釋度的對(duì)數(shù)
D:稀釋度對(duì)數(shù)之間的差
S:陽(yáng)性孔比率總和
lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5)
       =-3.875
TCID50=10-3.875/0.1ml
含義:將該病毒稀釋103.875接種100µl可使50%的細(xì)胞發(fā)生病變。
 
  
Marc 145細(xì)胞培養(yǎng)和維持綜述
發(fā)布: 2010-02-10 來(lái)自: 易生物實(shí)驗(yàn) 閱讀數(shù):5241次 
一、 細(xì)胞及培養(yǎng)
1、Marc145細(xì)胞
上皮樣細(xì)胞,來(lái)源于猴腎細(xì)胞,從母細(xì)胞(MA 104細(xì)胞)克隆而得到,可連續(xù)培養(yǎng)。
2、生長(zhǎng)培養(yǎng)基
DMEM(高糖型,含4500mg/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺,和110mg/L丙酮酸鈉,不含碳酸氫鈉)+5-10%新生牛血清+ 1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的培養(yǎng)液。
3、凍存液
生長(zhǎng)培養(yǎng)基+10% DMSO
4、細(xì)胞健康生長(zhǎng)的幾項(xiàng)注意事項(xiàng)
(1)細(xì)胞沒(méi)有支原體等外源因子的感染。
(2)培養(yǎng)液的pH值可在7.0-7.3,以7.2為佳。
(3)一般按1:3傳代,細(xì)胞接種密度為1-1.5×105cells/ml,48hr后長(zhǎng)成單層。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
(4)培養(yǎng)基和血清的質(zhì)量可靠、穩(wěn)定;建議采用特級(jí)小牛血清。
(5)細(xì)胞及時(shí)傳代,不可以在老化后傳代,一般在剛長(zhǎng)成細(xì)胞單層時(shí)進(jìn)行傳代、擴(kuò)增。
(6)細(xì)胞傳代時(shí)消化液用0.25%胰蛋白酶+0.03%EDTA,消化過(guò)程應(yīng)盡量縮短在1~2分鐘內(nèi)完成。
二、 病毒感染、維持和收獲
轉(zhuǎn)瓶中細(xì)胞長(zhǎng)成單層后,棄瓶?jī)?nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)液,接種PRRS病毒。37℃吸附1hr,加入維持液,置37℃恒溫室轉(zhuǎn)瓶機(jī)上旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)3-5天。
維持液:DMEM+4~5%新生牛血清。
pH應(yīng)為7.4~7.8;后期維持pH會(huì)慢慢降下來(lái)。
細(xì)胞病變時(shí)間出現(xiàn)在接毒后48小時(shí),72~96小時(shí)細(xì)胞病變達(dá)80%左右,當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)80%以上病變(CPE)時(shí),即可開(kāi)始收毒;反復(fù)傳過(guò)幾代后病變時(shí)間可縮短。
第3、4天注意觀察,細(xì)胞病變(CPE)達(dá)到80%時(shí)收獲病毒,-20℃凍融3次,混勻病毒懸液,96孔板測(cè)定TCID50。
收液時(shí)需要將含毒細(xì)胞反復(fù)凍融2~3次以破碎細(xì)胞,將病毒釋放到培養(yǎng)液中。
三、 細(xì)胞病變(CPE)
細(xì)胞在接種病毒后,24-48hr開(kāi)始出現(xiàn)病變,72-96hr約達(dá)到80%病變。病變現(xiàn)象:細(xì)胞空泡化、圓縮、先灶狀脫落,再大片脫落,**后整個(gè)細(xì)胞裂解、破碎。圖1是指PRRSV感染后,出現(xiàn)細(xì)胞病變的Marc 145細(xì)胞。
四、 PRRS病毒在細(xì)胞中增殖規(guī)律( Virology Journal, 2006, 3: 90)
PRRS病毒感染Marc 145細(xì)胞過(guò)程可大致分為兩個(gè)感染階段,**階段:病毒感染細(xì)胞后的20-22hr左右,僅部分細(xì)胞被隨機(jī)感染,而且Marc 145細(xì)胞對(duì)PRRS病毒的低感染性(low permissiveness)與MOI量無(wú)關(guān),因?yàn)镸OI劑量比常規(guī)量提高100倍,感染22hr后,仍僅5.5%的細(xì)胞呈PRRSV陽(yáng)性(PRRSV-positive)。第二階段:感染后的2-3天(也稱為病毒的對(duì)數(shù)感染期),病毒感染蔓延是通過(guò)相鄰細(xì)胞和細(xì)胞之間的接觸感染,細(xì)胞對(duì)自由病毒不敏感(Cells is nonpermissive to free Virus),并出現(xiàn)了感染細(xì)胞群。 感染過(guò)程如圖5所示。
對(duì)我們的一點(diǎn)啟示:可以采用適當(dāng)?shù)土康腗OI進(jìn)行病毒感染,比如0.05virus/cell;同時(shí),大部分細(xì)胞在維持期的**天尚需繼續(xù)生長(zhǎng),而且病毒在2-4天才是感染、增殖的高峰,較長(zhǎng)的病毒維持期均需要供給豐富的營(yíng)養(yǎng)物資,可以相信:維持液的營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)病毒增殖效率有非常重要的影響
細(xì)胞的復(fù)蘇
一、細(xì)胞復(fù)蘇的原則
在實(shí)際操作中,凍存細(xì)胞要進(jìn)行復(fù)蘇,再培養(yǎng)傳代。復(fù)蘇細(xì)胞一般采用快速融化法。以保證細(xì)胞外結(jié)晶快速融化,以避免慢速融化水分滲入細(xì)胞內(nèi),再次形成胞內(nèi)結(jié)晶損傷細(xì)胞。
二、細(xì)胞復(fù)蘇的主要操作步驟
(1)佩戴眼鏡和手套,從液氮罐中取出安瓿或冷凍管。
(2)迅速放入38℃水浴中,并不時(shí)搖動(dòng),在1分鐘內(nèi)使其完全融化,然后在無(wú)菌下取出細(xì)胞。
(3)在1000r/min速度下離心5~10分鐘,棄去上層液,加入適量培養(yǎng)液后接種于培養(yǎng)瓶中,接種濃度1×109/L,置37℃溫箱靜置培養(yǎng),次日更換一次培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng),觀察生長(zhǎng)情況。若細(xì)胞密度較高,及時(shí)傳代。或無(wú)需離心直接將細(xì)胞加入瓶中,并加入培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)12~24小時(shí)后,充去上清,換入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
三、注意事項(xiàng)
在細(xì)胞復(fù)蘇操作時(shí),應(yīng)注意融化凍存細(xì)胞速度要快,可不時(shí)搖動(dòng)安瓿或冷凍管,使之盡快通過(guò)**易受損的溫度段(-5~0℃)。這樣復(fù)蘇的凍存細(xì)胞存活率高,生長(zhǎng)及形態(tài)良好。然而,由于凍存的細(xì)胞還受其他因素的影響,有時(shí)也會(huì)有部分細(xì)胞死亡。此時(shí),可將不貼壁、飄浮在培養(yǎng)液上(已死亡)的細(xì)胞輕輕倒掉,再補(bǔ)以適量的新培養(yǎng)液,也會(huì)獲得較為滿意的結(jié)果。
 
 
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