【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?br /> 1.學(xué)習(xí)掌握細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理以及具體方法，并對小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)；
2.掌握無菌操作的具體過程及無菌操作臺的使用；
3.學(xué)習(xí)掌握染色法鑒別細(xì)胞的生死狀態(tài)的原理及方法；
4.學(xué)習(xí)使用血球計(jì)數(shù)板對細(xì)胞總數(shù)及活細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)；
【實(shí)驗(yàn)原理】
1.細(xì)胞培養(yǎng)
細(xì)胞培養(yǎng)指的是在無菌條件下，把動、植物細(xì)胞從組織中取出，在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，使離體的細(xì)胞在體外生長和繁殖，并且維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。動物細(xì)胞培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。從供體獲得組織細(xì)胞，在無菌條件下，用胰蛋白酶消化或機(jī)械分散等方法，將動物組織分散成單個(gè)細(xì)胞開始**培養(yǎng)長出單層細(xì)胞的方法稱為細(xì)胞的原代培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)的動物細(xì)胞生長增殖達(dá)到一定密度，形成致密的單層細(xì)胞時(shí)，用胰蛋白酶將細(xì)胞消化分散成單細(xì)胞，從一個(gè)容器中以1：2或其他比例轉(zhuǎn)移到另一個(gè)容器中擴(kuò)大培養(yǎng)的方法，稱為細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)的累計(jì)次數(shù)就是細(xì)胞的培養(yǎng)代數(shù)。
高等生物是由多細(xì)胞構(gòu)成的整體，在整體條件下要研究單個(gè)細(xì)胞或某一群細(xì)胞在體內(nèi)的功能活動是十分困難的。但如果把活細(xì)胞拿到體外培養(yǎng)、增殖并進(jìn)行觀察和研究，則要方便和簡單得多。被培養(yǎng)的動物胞是非常好的實(shí)驗(yàn)對象和實(shí)驗(yàn)研究材料，對體外培養(yǎng)的活細(xì)胞進(jìn)行研究可以幫助人類揭開生、老、病、死的規(guī)律，探索優(yōu)生、抗衰老和防治各種疾病的途徑和機(jī)制，也可以人為地誘導(dǎo)和改變細(xì)胞的遺傳性狀和特性，使其向有利于人類健康長壽的方向發(fā)展。因此動物細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)是研究細(xì)胞分子機(jī)制非常重要的實(shí)驗(yàn)手段，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物技術(shù)、基因工程等研究*域。
細(xì)胞培養(yǎng)的意義
具有其他生物技術(shù)無可比擬的優(yōu)點(diǎn)；培養(yǎng)條件易改變和控制，便于單因子分析；便于人們直接對細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞生長及發(fā)育等過程的觀察；在生物學(xué)的各個(gè)*域（如分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)及病毒學(xué)等）已被廣泛應(yīng)用。
細(xì)胞培養(yǎng)的局限性：在脫離機(jī)體復(fù)雜環(huán)境下，細(xì)胞培養(yǎng)條件與軀體環(huán)境有一定距離；觀察到的結(jié)果有時(shí)難以正確反映機(jī)體內(nèi)的狀況；細(xì)胞培養(yǎng)得到的產(chǎn)物少。培養(yǎng)細(xì)胞的條件有水的質(zhì)量、無菌環(huán)境，**適溫度、滲透壓、氣體條件、**適PH、營養(yǎng)條件和培養(yǎng)基質(zhì)等。
2.細(xì)胞死活鑒定
細(xì)胞生死狀態(tài)的鑒別方法主要是化學(xué)染色法和熒光染色法。
活細(xì)胞和死亡細(xì)胞在生理技能和性質(zhì)上主要存在一下差異：
①細(xì)胞膜通透性的差異：活細(xì)胞的細(xì)胞膜是一種選擇性膜，對細(xì)胞起保護(hù)和屏障作用，只允許物質(zhì)選擇性地通過；而細(xì)胞死后，細(xì)胞膜受損，其通透性增加。基于此，發(fā)展出了以臺盼藍(lán)、伊紅、苯胺黑、赤蘚紅、甲基藍(lán)以及熒光染料碘化丙啶或溴化乙啶等為染料鑒別細(xì)胞生死狀態(tài)的方法，上述染料能使死亡細(xì)胞著色，而活細(xì)胞不被著色。此外，應(yīng)用植物質(zhì)壁分離的性質(zhì)也可鑒定植物細(xì)胞的生死狀態(tài)。活細(xì)胞的原生質(zhì)具有選擇透過性，死細(xì)胞因其原生質(zhì)的選擇透過性已遭破壞，故與高滲透壓溶液接觸時(shí)不產(chǎn)生質(zhì)壁分離。
②代謝上的差異：活細(xì)胞中新陳代謝作用強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)的酶具有較強(qiáng)的活性和還原能力?；诖耍l(fā)展處了以熒光素二乙酸酯（FDA）、熒光素二丙酸酯、熒光素二丁酸酯或熒光素二苯甲酰酯等酯化的熒光素鑒別細(xì)胞生死狀態(tài)的方法，上述酯化的熒光素親脂性提高，容易被細(xì)胞吸收進(jìn)入，活細(xì)胞內(nèi)的酯酶具有較強(qiáng)的活性，可將酯化的熒光素分解而釋放出能發(fā)熒光的熒光素，該物質(zhì)不能自由透過活的細(xì)胞膜，積累在細(xì)胞內(nèi)，熒光顯微鏡下顯示有明亮的綠色或黃綠色熒光；而死亡細(xì)胞內(nèi)的酯酶因失去活性，不能分解酯化的熒光素，熒光顯微鏡下顯示不發(fā)光。另外，可用亞甲基藍(lán)為染料鑒定酵母細(xì)胞的生死狀態(tài)。亞甲基藍(lán)是一無毒染料，氧化型為藍(lán)色，還原型為無色。活細(xì)胞因具有較強(qiáng)的還原能力，能使亞甲藍(lán)從藍(lán)色的氧化型
變成無色的還原型，故活的酵母細(xì)胞在用亞甲基藍(lán)染色后顯示無色；死亡酵母細(xì)胞或代謝緩慢的衰老酵母細(xì)胞，因無還原能力或還原能力極弱，使亞甲藍(lán)仍處于氧化態(tài)，故呈現(xiàn)藍(lán)色或淡藍(lán)色。
3.血球計(jì)數(shù)板的使用
血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚載玻片，載玻片上有4條槽而構(gòu)成3個(gè)平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個(gè)半邊上面各有一個(gè)方格網(wǎng)如圖（3)。每個(gè)方格網(wǎng)共分
9大格，其中間的一大格又稱為計(jì)數(shù)常被用作微生物的計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)室的刻度有兩種：一種是大方格分為16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格；另一種是一個(gè)大方格分成25
個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格。但是不管計(jì)數(shù)室是哪一種構(gòu)造，它們都有一個(gè)共同特點(diǎn)，即每個(gè)大方格都由400個(gè)小方格組成(圖4)每個(gè)大方格邊長為1mm，則每一大方格的面積為1mm²每個(gè)小方格的面積為1/400mm²，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與計(jì)數(shù)室底部之間的高度為0.1mm，所以每個(gè)計(jì)數(shù)室(大方格)的體積為0.1mm³，每個(gè)小方格的體積為1／4000mm³。使用血球計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)時(shí)，先要測定每個(gè)小方格(或中方格)中微生物的數(shù)量，再換算成每毫升菌液(或每克樣品)中微生物細(xì)胞的數(shù)量。
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圖1 血球計(jì)數(shù)板構(gòu)造（上、平面圖；下、側(cè)面圖） 圖2血球計(jì)數(shù)板的網(wǎng)絡(luò)分區(qū)與分格
【實(shí)驗(yàn)用品】
1.材料：
小鼠脾臟；
2.試劑：
PBS緩沖溶液、培養(yǎng)液、伊紅；
3.器材：
解剖剪、解剖鑷、眼科剪、眼科鑷、培養(yǎng)皿、紗布塊、吸管、橡皮頭、燒杯、移液槍、注射器、針頭、Eppendorf管（上述器具徹底清洗、消毒、烤干、包裝好）、倒置相差顯微鏡、酒精燈、酒精棉球、試管架、解剖板等。
【操作步驟】
A.原代脾細(xì)胞培養(yǎng)
1、取材：
取小白鼠一只，采用斷頭法處死，清水洗凈小白鼠并浸于75%酒精中滅菌3min，取出轉(zhuǎn)入超凈工作臺內(nèi)的解剖盤內(nèi)，無菌操作打開腹腔，取出脾臟，去除周圍的脂肪組織，鑷起脾臟用PBS液自上而下沖洗1-2次，轉(zhuǎn)入無菌玻璃培養(yǎng)皿中，待用。
2、分離脾細(xì)胞：
形用滴管先向上述無菌玻璃培養(yǎng)皿中滴入 PBS液30滴，再用L行針頭注射器在皿內(nèi)吸取
PBS液0.2ml，然后將其沿脾臟長軸方向注射入脾內(nèi)，用針尖在脾臟上扎眼，并用L形針頭輕刮脾臟表面擠出脾細(xì)胞，用滴管吸皿中的PBS液沖洗脾臟并吹散掛出的脾細(xì)胞，稍微傾斜并靜置1-2min，吸取上述靜置后的脾細(xì)胞懸液上清部分放入Eppendorf管，以3000轉(zhuǎn)/分離心1-2min
3、培養(yǎng)脾細(xì)胞：
從超凈工作臺中區(qū)塑料培養(yǎng)皿一個(gè)，用“槍（1ml）”加入細(xì)胞培養(yǎng)液2ml，并在皿上做記號，待用。取上述離心后的Eppendorf管，在超凈工作臺內(nèi)打開棄去上清液，用“槍（200μl）
”吸取塑料皿中的培養(yǎng)液400ul加入棄去上清液的Eppendorf管中用槍頭吹勻管底的脾細(xì)胞，
然后吸取200ul脾細(xì)胞懸液接種于上述塑料培養(yǎng)皿中，混勻，然后放入37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
B.細(xì)胞死活鑒定
伊紅法：
1、試劑配制：
生理鹽水配置0.15%伊紅染液，備用。
2、細(xì)胞懸液制備：
 將生長有貼壁型細(xì)胞的培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液倒入干凈試管中，向培養(yǎng)皿中加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液1-2ml，靜置3-5min，待見到細(xì)胞變圓，彼此不連接為止，棄去混合消化液并將上述試管中的培養(yǎng)液倒回培養(yǎng)瓶中，用滴管輕輕吹打細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。
3、染色制片：
取0.5ml細(xì)胞懸液放于干凈的試管中，加1-2滴（約0.1ml）染液，混合，2min后制成臨時(shí)裝片，鏡檢。
4、染色結(jié)果：
死細(xì)胞染成紅色，活細(xì)胞不著色。
C.用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)
1、染色計(jì)數(shù)：
2、取上述步驟二所制備0.5ml細(xì)胞懸液放于干凈的試管中，加1-2滴（約0.1ml）染液，混合2-5min滴加少許染色后的細(xì)胞懸液于放有蓋片的血球計(jì)數(shù)板的斜面上，使懸液自然充滿計(jì)數(shù)板小室（注意：不要使小室內(nèi)有氣泡產(chǎn)生，否則要重新滴加；在普通光鏡10物鏡下計(jì)數(shù)四個(gè)大格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，壓線者數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右）。
2、根據(jù)染色結(jié)果計(jì)算活細(xì)胞率：
依據(jù)死細(xì)胞染成紅色、活細(xì)胞不著色的原則計(jì)數(shù)死細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，以如下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：
活細(xì)胞率（%）=（細(xì)胞總數(shù)-死細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)*100%
【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】
A.細(xì)胞原代培養(yǎng)結(jié)果：
。
B細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果：

項(xiàng)目	1	2	3	4
細(xì)胞總數(shù)	85	60	81	58
活細(xì)胞數(shù)	29	11	14	12

每個(gè)中格平均細(xì)胞總數(shù)為71
平均活細(xì)胞數(shù)為17
活細(xì)胞率=活細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%=17/71*100%=23.9%
細(xì)胞密度=中格平均活細(xì)胞數(shù)×5×10000×稀釋倍數(shù)
        =17*5*10000*1
        =8.5*10⁵ /ml
【注意事項(xiàng)】
1、小鼠一定要將血放干凈并且在酒精中充分浸泡3min，防止雜菌污染無菌操作臺；
2、為近一步保證無菌操作臺的無菌環(huán)境，可在玻璃擋板口點(diǎn)一酒精燈，一般操作都在酒精燈火焰旁操作；
3、取小鼠脾時(shí)注意保持其完整，注入緩沖液要慢而準(zhǔn)且適量，不要撐破脾臟，保證細(xì)胞分散游離出來，也不能使游離的細(xì)胞中含有塊兒狀物質(zhì)；
4、培養(yǎng)液PH為7.0～7.4，其中加有酚酞，正常狀況細(xì)胞生長過程代謝物使PH下降，培養(yǎng)液的顏色改變呈黃色，因此可通過培養(yǎng)液顏色變化初步判斷細(xì)胞生長狀況；
5、生長狀況良好的細(xì)胞膜和核完整，細(xì)胞質(zhì)透明，而細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)較多顆粒狀或空泡證明細(xì)胞衰老。除游離期和衰退期外細(xì)胞一般貼壁生長。游離期細(xì)胞一般圓形，折光率高，而衰退期細(xì)胞皺縮，透明度下降，立體感很差，較易區(qū)分；
6、倒置顯微鏡將物鏡與載物臺間的空間解放，可以允許連同培養(yǎng)皿一同觀察。