實驗器材與生物試劑
干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶 ,青霉素、鏈霉素. 純凈水系統(tǒng)、電子天平 、PH計 、磁力攪拌器 。
具體步驟
一.水的制備
細胞培養(yǎng)用水必須非常純凈,不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水
二.PBS的制備與消毒(也可用于其它BSS,如:Hanks,D-Hanks液的配制)
1.溶解定容:將藥品(NaCl 8.0g,KCl 0.2g,Na2HPO4•H2O 1.56g,KH2PO4 0. 2g )倒入盛有雙蒸水的燒杯中,玻璃棒攪動,充分溶解,然后把溶液倒入容量瓶 中準(zhǔn)確定容**1000ml,搖勻即成新配制的PBS溶液。
2.移入溶液瓶內(nèi)待消毒:將PBS倒入溶液瓶(大的吊針瓶)內(nèi),蓋上膠,并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)120℃消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾 水補充蒸發(fā)掉的水份。
三.胰蛋白酶 溶液的配制與消毒
胰蛋白酶的作用是使細胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細胞離散。不同的組織或者細胞對胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細胞的活性還與其濃度、溫度和作用時間有關(guān),在pH為8.0、溫度為37℃時,胰酶溶液的作用能力**強。使用胰酶時,應(yīng)把握好濃度、溫度和時間,以免消化過度造成細胞損傷。因Ca2+、Mg2+和血清 、蛋白質(zhì)克降低胰酶的活性,所以配制胰酶溶液時應(yīng)選用不含Ca2+、Mg2+的 BSS,如:D-Hanks液。終止消化時,可用含有血清 培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細胞的作用。
1.稱取胰蛋白酶:按胰蛋白酶液濃度為0.25%,用電子天平 準(zhǔn)確稱取粉劑溶入小燒杯 中的雙蒸水(若用雙蒸水需要調(diào)PH到 7.2左右)或PBS(D-hanks)液中。攪拌混勻,置于4℃內(nèi)過夜。
2.用注射濾器抽濾消毒:配好的胰酶溶液要在超凈臺內(nèi)用注射濾器(0.22微米微孔濾膜)抽濾除菌。然后分裝成小瓶于-20℃保存以備使用。
四.青、鏈霉素溶液的配制與消毒
1. 所用純凈水(雙蒸水)需要15磅高壓20分鐘滅菌。
2.具體操作均在超凈臺內(nèi)完成。青霉素是80萬單位 /瓶,用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬單位/瓶,加5ml滅菌雙蒸水,即每毫升各為20萬單位。
3.使用時溶入培養(yǎng)液中,使青鏈霉素的濃度**終為 100單位/ml。1單位=1微克
五.RPMI1640的制備與消毒:
1.溶解、調(diào)PH值、定容:先將微生物培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3的雙蒸水中,并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次(沖洗液一并加入微生物培養(yǎng)基中),充分?jǐn)嚢?*粉劑全部溶解,并按照包裝說明添加一定的藥品.然后用注射器向微生物培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5ml, 使青鏈霉素的濃度**終各為100單位/ml。然后用一個當(dāng)量的鹽酸和NaOH調(diào)PH到7.2左右。**后定容**1000ml,搖勻。
2.安裝蔡式濾器:安裝時先裝好支架,按規(guī)定放好濾膜,用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。
3.抽濾:配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺內(nèi)過濾。
4.分裝:將過濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶內(nèi)置于4℃冰箱內(nèi)待用。
5.使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液(4℃時兩周有效)。