細(xì)胞培養(yǎng)
一、培養(yǎng)基的配制
a. RPMI 1640 1× (with L-glutamine) 類培養(yǎng)基組分:RPMI ,10%FBS(胎牛血清),雙抗生素(penicillin,盤尼西林(青霉素), streptomycin,鏈霉素);
配制方法:500 ml RPMI(一瓶) + 50 ml FBS + 5 ml 雙抗生素
b. DMEM 1× 類培養(yǎng)基組分: DEMI,10% FBS,雙抗生素;
配制方法:500 ml DMEM(一瓶) + 50 ml FBS + 5 ml 雙抗生素
二、培養(yǎng)細(xì)胞RNA的提取
1.從培養(yǎng)箱中拿出6孔板(每孔培養(yǎng)2 ml),吸出培養(yǎng)液;
2.PBS清洗;用大槍管吸取PBS加入每個培養(yǎng)孔中(槍頭不要觸碰培養(yǎng)板,防止交叉污染),用1 ml槍吹勻清洗(把培養(yǎng)板傾斜,吸溶液指**高處打出)。重復(fù)以上操作一次。
3. 每孔中加1 ml Trizol ,吸出放-80℃冰箱冷凍。
三、培養(yǎng)細(xì)胞DNA的提取
1.從培養(yǎng)箱中拿出6孔板(每孔培養(yǎng)2 ml),吸出培養(yǎng)液;
2.PBS清洗;用大槍管吸取PBS加入每個培養(yǎng)孔中(槍頭不要觸碰培養(yǎng)板,防止交叉污染),用1 ml槍吹勻清洗(把培養(yǎng)板傾斜,吸溶液****高處打出)。重復(fù)以上操作一次。
3. 向培養(yǎng)板中加酶消化(時間較長,放進(jìn)培養(yǎng)箱,看到有白色懸浮后取出),取出加DMEM類培養(yǎng)基;
4. 吸出** 1.5 ml 離心管,3600 rpm,4 min離心;
5. 吸出上清(不要觸及沉淀),加 PBS 1ml清洗,3600 rpm,4 min離心;
四、常用細(xì)胞系(人)
名稱 細(xì)胞類型 來源 核型 培養(yǎng)液
A431 上皮型 表皮細(xì)胞腫瘤 非整倍體(76, XX) DMEM+10%FBS
HeLa 上皮樣 宮頸癌 非整倍體(81-83,XX) MEM+NEAA 10%FBS
Hep G2 上皮樣 肝細(xì)胞癌 非整倍體(55,XY) MEM+NEAA 10%FBS
MEM:極限必需培養(yǎng)液(Eagle);NEAA:非必需氨基酸;DMEM:Dulbecco’s MEM改良培養(yǎng)液;
RPMI:Roswell Park Memorial 研究所;BrdU:5-溴脫氧尿苷;APRI:腺苷磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶
實(shí)驗室除snu系列與G產(chǎn)7721用1640培養(yǎng)基,其它用DMEM培養(yǎng)基。
五、原代培養(yǎng)----肝細(xì)胞
1.切除乳鼠肝臟組織放進(jìn)小燒杯中,用PBS或培養(yǎng)液漂洗2-3次,去除血污;
2.加少量培養(yǎng)液,用剪子把組織剪碎,1 平方mm左右,再用吸管吹打;
3.加含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液,制成均勻的細(xì)胞懸液,移入培養(yǎng)瓶,將組織塊放在培養(yǎng)瓶底部,采用薄層營養(yǎng)液培養(yǎng)法,蓋上瓶蓋。
4.換液,只將舊的培養(yǎng)液吸棄,換上新的培養(yǎng)基。
六、傳代培養(yǎng)
1.顯微鏡觀察是否需要傳代
細(xì)胞生長良好:上清液清亮,無懸浮物,折光性好,均質(zhì)而透明,胞膜完整,胞內(nèi)顆粒少,無空泡和脂滴。
細(xì)胞生長不良:懸浮物多,發(fā)差增大,胞膜不完整,胞質(zhì)中顆粒多,出現(xiàn)空泡和脂滴。
2.貼壁細(xì)胞傳代
①吸出瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液;
②用PBS輕緩漂洗細(xì)胞,兩遍,小皿,2 ml,大皿, 4 ml,盡量棄去舊培養(yǎng)液(防止消化液被稀釋,造成效力下降);
③向培養(yǎng)皿中加入適量胰蛋白酶,37℃ 2-3 min,(消化標(biāo)準(zhǔn):細(xì)胞突起回縮,細(xì)胞間隙增大,細(xì)胞近乎圓形);
④加入一定培養(yǎng)液(小皿 1 ml,大皿 2 ml),終止消化反應(yīng),反復(fù)吹打貼壁細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液;
⑤傳代/棄掉, 剩余的細(xì)胞懸液加新的培養(yǎng)液,小皿 4-5 ml,大皿 10-12 ml;
⑥貼上細(xì)胞名稱,代數(shù),時間
3.懸浮細(xì)胞的傳代
懸浮細(xì)胞不貼壁生長,傳代時無需使用消化液處理;
懸浮細(xì)胞不貼附于支持物,胞體圓形,培養(yǎng)液中生長空間大,可長時間生長,便于做細(xì)胞代謝研究;
七、凍存細(xì)胞的復(fù)蘇(提前開水浴箱37℃)
1.常用的凍存液:甘油,DMSO(二甲基亞砜,**常用,常溫時對細(xì)胞有很強(qiáng)細(xì)胞毒作用,凍存過程中細(xì)胞代謝停止,不能發(fā)揮細(xì)胞毒作用)。
2.原則:快速融化,保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短時間內(nèi)融化,避免由于緩慢融化使水分溶入細(xì)胞內(nèi)形成細(xì)胞內(nèi)再結(jié)晶對細(xì)胞造成損傷;緩慢加液,加培養(yǎng)液時要慢,防止?jié)B透壓劇烈變化,造成細(xì)胞損傷;
加入冷的5-10倍的培養(yǎng)液充分稀釋凍存液,以使DMSO對細(xì)胞的毒性作用降到**低點(diǎn)。
3.步驟:
①提前將恒溫水浴箱調(diào)到37℃-42℃預(yù)熱;取離心管、培養(yǎng)皿(酒精燈滅菌); 培養(yǎng)不同細(xì)胞,專管專用;
②將放在4℃冰箱平衡的細(xì)胞培養(yǎng)液拿出,用帶有消毒水的紗布擦后放進(jìn)超凈臺,瓶經(jīng)灼燒后將蓋擰松待用(避免開蓋時間過長,PH改變);
③在刻度離心管中加入5-6 ml 的培養(yǎng)液;
④從液氮中取出凍存管,用鑷子夾其蓋部,在37℃溫水中快速搖動,管口不要遇水;#p#分頁標(biāo)題#e#
⑤凍存管迅速過火開蓋,將底部細(xì)胞輕輕吹打起來,移**刻度離心管中;
⑥離心,離心對細(xì)胞不利,要低速離心,800-1000r/min, 3 min,實(shí)驗室1200r/min,5 min; 在6 cm培養(yǎng)皿中加入培養(yǎng)液;
⑦離心完畢,離心管過火,將凍存液一次性倒進(jìn)廢液缸,管口過火,加入新鮮培養(yǎng)液,輕輕吹打,移**培養(yǎng)皿中;
⑧相差顯微鏡觀察細(xì)胞的狀況;復(fù)蘇標(biāo)準(zhǔn):1.折光性:健康細(xì)胞立體感強(qiáng),細(xì)胞內(nèi)顆粒少,非常透明,折光率高;2.細(xì)胞是否完整,細(xì)胞是否飽滿。
八、細(xì)胞凍存:在體外培養(yǎng)細(xì)胞懸浮,加有冷凍保護(hù)劑(DMSO)的溶劑中,降**某溫度,并在此溫度長期保存。
原則:慢凍速融;緩慢凍存:可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外,減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,從而減少由于冰晶造成的細(xì)胞損傷;
凍存細(xì)胞:取10代以內(nèi)為宜;
步驟:
1.配制凍存液;① 30%血清+60%培養(yǎng)液+10%DMSO;②細(xì)胞不好培養(yǎng)時:90%血清+10%DMSO;
2.對數(shù)生長的貼壁細(xì)胞,棄去舊培養(yǎng)液,PBS洗兩次;
3.加入胰酶消化,制成細(xì)胞懸液(懸浮生長則直接移**離心管中),800-1000 r/min離心5 min,棄上清;
4.加入凍存液,用吸管輕輕吹打,使細(xì)胞均勻,計數(shù),凍存**終密度**少1×10的六次方;
5.按每管0.5-1 ml的量,將細(xì)胞懸液均勻裝入凍存管,擰緊管蓋;
6.標(biāo)明凍存細(xì)胞名稱,日期,操作者;
7.凍存直接關(guān)系到細(xì)胞復(fù)蘇時的活力,分級凍存:4℃冰箱30min----轉(zhuǎn)入-20℃冰箱 30—60 min------轉(zhuǎn)入-70℃--80℃冰箱過夜---------將凍存管放入-196℃液氮罐中保存;
注意事項:①凍存**好為對數(shù)生長期細(xì)胞,凍存前****好換一次液;②凍存和復(fù)蘇**好用新的培養(yǎng)基;
③細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵是0—20℃的處理(在此溫度范圍內(nèi),冰晶呈針狀,極易導(dǎo)致細(xì)胞損傷);④DMSO無需滅菌(滅菌會破壞其分子結(jié)構(gòu)導(dǎo)致降低冷凍效果)
九、收細(xì)胞
1.用槍將培養(yǎng)基吸棄;
2.1 ml PBS洗(一定要輕柔,防止將細(xì)胞吸去)用槍將棄液吸棄;
3.再加1 mlPBS吹打細(xì)胞,(因293T細(xì)胞是半貼壁細(xì)胞,不用胰酶消化)將細(xì)胞全部吸打到液體中;
4.將液體轉(zhuǎn)入1.5 ml EP管,離心2000—3000 R,3—5 min;
5.用槍頭吸凈上清;
6.冷凍**-80℃冰箱;
若為貼壁細(xì)胞:1.將舊培養(yǎng)基吸棄;2.加胰酶消化細(xì)胞;3.加入新培養(yǎng)液中和胰酶;4.將液體轉(zhuǎn)入1.5 ml EP管,離心,棄上清;6.用1 ml PBS 清兩遍,棄凈上清;7.凍**-80℃冰箱;
二、提取RNA
一、工作臺處理及RNA專用器材;用Erasol 處理工作臺面;RNase-free 的槍頭,EP管;
二、試劑準(zhǔn)備
1.Trizol試劑;
2.氯仿(提RNA專用);
3.異丙醇(提RNA專用);
4.75%乙醇(DEPC水配制);
5.高壓處理的DEPC水:1000 ml雙蒸水加入1 mlDEPC,37℃過夜,高壓;
三、操作步驟
1.細(xì)胞處理:棄培養(yǎng)液,用預(yù)冷的PBS洗2遍,加入Trizol(小皿加1 ml,大皿加2 ml;關(guān)鍵步驟,含醋酸鈉,在酸性環(huán)境RNA與蛋白質(zhì)分離,DNA不分離,DNA與蛋白質(zhì)被沉淀下來),混勻,室溫靜置5 min;
2.反復(fù)吹打,將液體轉(zhuǎn)入1.5 ml EP管中,加入0.2 ml氯仿,劇烈震蕩15 S,靜置5 min;
3.4℃離心,12000 g,15 min,樣品分三層,取上清(注意不要吸到中間的白色層,否則易造成DNA污染);
4.加入0.5 ml異丙醇,將管中液體輕輕混勻,室溫靜置10 min;
5.4℃離心,12000 g 10min,棄上清;
6.加入1 ml 75%乙醇,輕輕洗滌沉淀,4℃離心,8000 g 5min,棄上清;
7.冰上晾干,加入適量的DEPC水溶解(20 ul);
8.取適量RNA進(jìn)行濃度測定和電泳檢樣,剩余的RNA立即放-70℃冰箱保存;
評價RNA質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)是RNA的均一性和完整性
均一性:OD是光密度值,A是吸光值,是同一個意思;A260是核酸(RNA/DNA)**大吸光值的波長;A280是蛋白質(zhì)**大吸光值的波長(A260/280比值可估計核酸純度);純DNA的A260/A280是1.8,純的RNA是2.0;比值太低說明有殘留的蛋白質(zhì),比值過高說明RNA降解;
完整性:由于細(xì)胞中大部分RNA是rRNA,因此在理想的電泳圖上能看到的條帶有兩個,28S、18S,且28S是18S的兩倍,如果RNA發(fā)生降解,則上述兩條帶變?nèi)趸蛳В霈F(xiàn)一條分子量很小的條帶;
組織蛋白提取 2014/4/2
RIPA
提取蛋白的lysis buffer: PI(蛋白抑制劑)
PMSF
把磨好的組織粉末加入2 ml離心管,加入200 ml lysis buffer,裂解30 min,12000 rpm離心