一、培養(yǎng)基的配制
a. RPMI 1640 1× （with L-glutamine） 類培養(yǎng)基組分：RPMI ，10%FBS（胎牛血清），雙抗生素（penicillin，盤尼西林（青霉素）， streptomycin，鏈霉素）；
配制方法：500 ml RPMI(一瓶) + 50 ml FBS + 5 ml 雙抗生素
b. DMEM 1× 類培養(yǎng)基組分： DEMI，10% FBS，雙抗生素；
配制方法：500 ml DMEM(一瓶) + 50 ml FBS + 5 ml 雙抗生素
 
二、培養(yǎng)細(xì)胞RNA的提取
1.從培養(yǎng)箱中拿出6孔板（每孔培養(yǎng)2 ml），吸出培養(yǎng)液；
2.PBS清洗；用大槍管吸取PBS加入每個培養(yǎng)孔中（槍頭不要觸碰培養(yǎng)板，防止交叉污染），用1 ml槍吹勻清洗（把培養(yǎng)板傾斜，吸溶液指**高處打出）。重復(fù)以上操作一次。
3. 每孔中加1 ml Trizol ，吸出放-80℃冰箱冷凍。
 
三、培養(yǎng)細(xì)胞DNA的提取
1.從培養(yǎng)箱中拿出6孔板（每孔培養(yǎng)2 ml），吸出培養(yǎng)液；
2.PBS清洗；用大槍管吸取PBS加入每個培養(yǎng)孔中（槍頭不要觸碰培養(yǎng)板，防止交叉污染），用1 ml槍吹勻清洗（把培養(yǎng)板傾斜，吸溶液****高處打出）。重復(fù)以上操作一次。
3. 向培養(yǎng)板中加酶消化（時間較長，放進(jìn)培養(yǎng)箱，看到有白色懸浮后取出），取出加DMEM類培養(yǎng)基；
4. 吸出** 1.5 ml 離心管，3600 rpm，4 min離心；
5. 吸出上清（不要觸及沉淀），加 PBS 1ml清洗，3600 rpm，4 min離心；
 
四、常用細(xì)胞系（人）
名稱          細(xì)胞類型             來源               核型                  培養(yǎng)液
A431          上皮型           表皮細(xì)胞腫瘤     非整倍體（76， XX）      DMEM+10%FBS
HeLa          上皮樣              宮頸癌        非整倍體（81-83，XX）     MEM+NEAA 10%FBS
Hep G2        上皮樣             肝細(xì)胞癌       非整倍體（55，XY）       MEM+NEAA 10%FBS
 
MEM：極限必需培養(yǎng)液（Eagle）；NEAA：非必需氨基酸；DMEM：Dulbecco’s MEM改良培養(yǎng)液；
RPMI：Roswell Park Memorial 研究所；BrdU：5-溴脫氧尿苷；APRI：腺苷磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶
實(shí)驗室除snu系列與G產(chǎn)7721用1640培養(yǎng)基，其它用DMEM培養(yǎng)基。
五、原代培養(yǎng)----肝細(xì)胞
1.切除乳鼠肝臟組織放進(jìn)小燒杯中，用PBS或培養(yǎng)液漂洗2-3次，去除血污；
2.加少量培養(yǎng)液，用剪子把組織剪碎，1 平方mm左右，再用吸管吹打；
3.加含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液，制成均勻的細(xì)胞懸液，移入培養(yǎng)瓶，將組織塊放在培養(yǎng)瓶底部，采用薄層營養(yǎng)液培養(yǎng)法，蓋上瓶蓋。
4.換液，只將舊的培養(yǎng)液吸棄，換上新的培養(yǎng)基。
 
六、傳代培養(yǎng)
1.顯微鏡觀察是否需要傳代
細(xì)胞生長良好：上清液清亮，無懸浮物，折光性好，均質(zhì)而透明，胞膜完整，胞內(nèi)顆粒少，無空泡和脂滴。
細(xì)胞生長不良：懸浮物多，發(fā)差增大，胞膜不完整，胞質(zhì)中顆粒多，出現(xiàn)空泡和脂滴。
 
2.貼壁細(xì)胞傳代
①吸出瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液；
②用PBS輕緩漂洗細(xì)胞，兩遍，小皿，2 ml，大皿， 4 ml，盡量棄去舊培養(yǎng)液（防止消化液被稀釋，造成效力下降）；
③向培養(yǎng)皿中加入適量胰蛋白酶，37℃ 2-3 min，（消化標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞突起回縮，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞近乎圓形）；
④加入一定培養(yǎng)液（小皿 1 ml,大皿 2 ml），終止消化反應(yīng)，反復(fù)吹打貼壁細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液；
⑤傳代/棄掉， 剩余的細(xì)胞懸液加新的培養(yǎng)液，小皿 4-5 ml,大皿 10-12 ml;
⑥貼上細(xì)胞名稱，代數(shù)，時間
 
3.懸浮細(xì)胞的傳代
懸浮細(xì)胞不貼壁生長，傳代時無需使用消化液處理；
懸浮細(xì)胞不貼附于支持物，胞體圓形，培養(yǎng)液中生長空間大，可長時間生長，便于做細(xì)胞代謝研究；
 
七、凍存細(xì)胞的復(fù)蘇（提前開水浴箱37℃）
1.常用的凍存液：甘油，DMSO（二甲基亞砜，**常用，常溫時對細(xì)胞有很強(qiáng)細(xì)胞毒作用，凍存過程中細(xì)胞代謝停止，不能發(fā)揮細(xì)胞毒作用）。
2.原則：快速融化，保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短時間內(nèi)融化，避免由于緩慢融化使水分溶入細(xì)胞內(nèi)形成細(xì)胞內(nèi)再結(jié)晶對細(xì)胞造成損傷；緩慢加液，加培養(yǎng)液時要慢，防止?jié)B透壓劇烈變化，造成細(xì)胞損傷；
加入冷的5-10倍的培養(yǎng)液充分稀釋凍存液，以使DMSO對細(xì)胞的毒性作用降到**低點(diǎn)。
3.步驟：
①提前將恒溫水浴箱調(diào)到37℃-42℃預(yù)熱；取離心管、培養(yǎng)皿（酒精燈滅菌）； 培養(yǎng)不同細(xì)胞，專管專用；
②將放在4℃冰箱平衡的細(xì)胞培養(yǎng)液拿出，用帶有消毒水的紗布擦后放進(jìn)超凈臺，瓶經(jīng)灼燒后將蓋擰松待用（避免開蓋時間過長，PH改變）；
③在刻度離心管中加入5-6 ml 的培養(yǎng)液；
④從液氮中取出凍存管，用鑷子夾其蓋部，在37℃溫水中快速搖動，管口不要遇水；#p#分頁標(biāo)題#e#
⑤凍存管迅速過火開蓋，將底部細(xì)胞輕輕吹打起來，移**刻度離心管中；
⑥離心，離心對細(xì)胞不利，要低速離心，800-1000r/min, 3 min,實(shí)驗室1200r/min,5 min; 在6 cm培養(yǎng)皿中加入培養(yǎng)液；
⑦離心完畢，離心管過火，將凍存液一次性倒進(jìn)廢液缸，管口過火，加入新鮮培養(yǎng)液，輕輕吹打，移**培養(yǎng)皿中；
⑧相差顯微鏡觀察細(xì)胞的狀況；復(fù)蘇標(biāo)準(zhǔn)：1.折光性：健康細(xì)胞立體感強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)顆粒少，非常透明，折光率高；2.細(xì)胞是否完整，細(xì)胞是否飽滿。
 
八、細(xì)胞凍存：在體外培養(yǎng)細(xì)胞懸浮，加有冷凍保護(hù)劑（DMSO）的溶劑中，降**某溫度，并在此溫度長期保存。
原則：慢凍速融；緩慢凍存：可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶造成的細(xì)胞損傷；
凍存細(xì)胞：取10代以內(nèi)為宜；
步驟：
1.配制凍存液；① 30%血清+60%培養(yǎng)液+10%DMSO；②細(xì)胞不好培養(yǎng)時：90%血清+10%DMSO；
2.對數(shù)生長的貼壁細(xì)胞，棄去舊培養(yǎng)液，PBS洗兩次；
3.加入胰酶消化，制成細(xì)胞懸液（懸浮生長則直接移**離心管中），800-1000 r/min離心5 min，棄上清；
4.加入凍存液，用吸管輕輕吹打，使細(xì)胞均勻，計數(shù)，凍存**終密度**少1×10的六次方；
5.按每管0.5-1 ml的量，將細(xì)胞懸液均勻裝入凍存管，擰緊管蓋；
6.標(biāo)明凍存細(xì)胞名稱，日期，操作者；
7.凍存直接關(guān)系到細(xì)胞復(fù)蘇時的活力，分級凍存：4℃冰箱30min----轉(zhuǎn)入-20℃冰箱 30—60 min------轉(zhuǎn)入-70℃--80℃冰箱過夜---------將凍存管放入-196℃液氮罐中保存；
注意事項：①凍存**好為對數(shù)生長期細(xì)胞，凍存前****好換一次液；②凍存和復(fù)蘇**好用新的培養(yǎng)基；
③細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵是0—20℃的處理（在此溫度范圍內(nèi)，冰晶呈針狀，極易導(dǎo)致細(xì)胞損傷）；④DMSO無需滅菌（滅菌會破壞其分子結(jié)構(gòu)導(dǎo)致降低冷凍效果）
 
九、收細(xì)胞
1.用槍將培養(yǎng)基吸棄；
2.1 ml PBS洗（一定要輕柔，防止將細(xì)胞吸去）用槍將棄液吸棄；
3.再加1 mlPBS吹打細(xì)胞，（因293T細(xì)胞是半貼壁細(xì)胞，不用胰酶消化）將細(xì)胞全部吸打到液體中；
4.將液體轉(zhuǎn)入1.5 ml EP管，離心2000—3000 R，3—5 min;
5.用槍頭吸凈上清；
6.冷凍**-80℃冰箱；
若為貼壁細(xì)胞：1.將舊培養(yǎng)基吸棄；2.加胰酶消化細(xì)胞；3.加入新培養(yǎng)液中和胰酶；4.將液體轉(zhuǎn)入1.5 ml EP管，離心，棄上清；6.用1 ml PBS 清兩遍，棄凈上清；7.凍**-80℃冰箱；
 
二、提取RNA
一、工作臺處理及RNA專用器材；用Erasol 處理工作臺面；RNase-free 的槍頭，EP管；
二、試劑準(zhǔn)備
1.Trizol試劑；
2.氯仿（提RNA專用）；
3.異丙醇（提RNA專用）；
4.75%乙醇（DEPC水配制）；
5.高壓處理的DEPC水：1000 ml雙蒸水加入1 mlDEPC，37℃過夜，高壓；
三、操作步驟
1.細(xì)胞處理：棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗2遍，加入Trizol(小皿加1 ml,大皿加2 ml;關(guān)鍵步驟，含醋酸鈉，在酸性環(huán)境RNA與蛋白質(zhì)分離，DNA不分離，DNA與蛋白質(zhì)被沉淀下來)，混勻，室溫靜置5 min;
2.反復(fù)吹打，將液體轉(zhuǎn)入1.5 ml EP管中，加入0.2 ml氯仿，劇烈震蕩15 S，靜置5 min;
3.4℃離心，12000 g，15 min，樣品分三層，取上清（注意不要吸到中間的白色層，否則易造成DNA污染）；
4.加入0.5 ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10 min;
5.4℃離心，12000 g 10min,棄上清；
6.加入1 ml 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀，4℃離心，8000 g 5min，棄上清；
7.冰上晾干，加入適量的DEPC水溶解（20 ul）；
8.取適量RNA進(jìn)行濃度測定和電泳檢樣，剩余的RNA立即放-70℃冰箱保存；
評價RNA質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)是RNA的均一性和完整性
均一性：OD是光密度值，A是吸光值，是同一個意思；A260是核酸（RNA/DNA）**大吸光值的波長；A280是蛋白質(zhì)**大吸光值的波長（A260/280比值可估計核酸純度）；純DNA的A260/A280是1.8，純的RNA是2.0；比值太低說明有殘留的蛋白質(zhì)，比值過高說明RNA降解；
完整性：由于細(xì)胞中大部分RNA是rRNA，因此在理想的電泳圖上能看到的條帶有兩個，28S、18S，且28S是18S的兩倍，如果RNA發(fā)生降解，則上述兩條帶變?nèi)趸蛳В霈F(xiàn)一條分子量很小的條帶；
 
 
組織蛋白提取 2014/4/2
                        RIPA
提取蛋白的lysis buffer:    PI(蛋白抑制劑)
                        PMSF
把磨好的組織粉末加入2 ml離心管，加入200 ml lysis buffer,裂解30 min，12000 rpm離心