實驗一 清洗與滅菌
一、實驗目的：能獨立地進行用于細胞培養(yǎng)的各種器皿的清洗與消毒，掌握干熱滅菌法、濕熱滅菌法和濾過除菌法的操作，了解化學消毒法的使用方法。
二、實驗原理 清洗與消毒是組織培養(yǎng)實驗的**步，是組織培養(yǎng)中工作量**大，也是**基本的步驟。體外培養(yǎng)細胞所使用的各種玻璃或塑料器皿對清潔和無菌的要求程度很高。細胞養(yǎng)不好與清洗不徹底有很大關(guān)系。清洗后的玻璃器皿，不僅要求干凈透明，無油跡，而且不能殘留任何物質(zhì)。如有毒的化學物質(zhì)，哪怕殘留0．1個，也可能影響細胞生長。滅菌手段的選擇十分重要，對不同的物品需采用不同的滅菌方法。假如選用的方法不對，即使達到了無菌卻使被滅菌藥品喪失了營養(yǎng)價值、生物學特性或其他使用價值也不行。以下在每種滅菌步驟中都介紹其使用范圍。
三、實驗材料、用品
1．材料：無臭氧型紫外燈，微孔濾膜(直徑25)：孔徑為0．22μm，微孔濾膜(直徑90)：孔徑為0．22 μm，過濾器(直徑25)。
2．藥品：70％或75％酒精，0．1％新潔爾滅，煤酚皂溶液(來蘇兒水)，0．5％過氧乙酸，乳酸，37％甲醛，高錳酸鉀，NaOH，鹽酸，重鉻酸鉀，濃硫酸(工業(yè))。
3．儀器：超凈臺，干燥箱，高壓蒸氣滅菌鍋，過濾器，過濾泵。
四、實驗步驟
(一)清洗
1．新玻璃器皿的清洗先用自來水刷洗，再浸泡5％稀鹽酸以中和玻璃表面的堿性物質(zhì)和其他有害物質(zhì)。
2．使用過的玻璃器皿的清洗
(1)使用過的培養(yǎng)用品應(yīng)立即浸入清水，避免干涸難洗。
(2)用洗滌劑清洗玻璃器皿，自來水清洗數(shù)遍，倒置自然干燥。
(3)浸酸性洗液過夜。
(4)從酸性洗液撈出后自來水沖洗10．15次去除殘余酸液，蒸餾水涮洗3次，倒置烘干。
(5)包裝(牛皮紙或一般紙)。
(6)高壓(15磅20 min)或干熱(170℃2 h)滅菌。
(7)貯存?zhèn)溆谩?br /> 3．膠塞的處理
(1)新膠塞應(yīng)先用清水清洗之后再用0．2％NaOH煮沸l(wèi)O-20 min。
(2)自來水清洗10次。
(3)再用1％稀鹽酸浸泡30 min。
(4)自來水清洗10次，蒸餾水涮洗3次。晾干，高壓滅菌(見(二)消毒與滅菌)。舊膠塞不必用酸堿處理可直接用洗滌劑煮沸和清洗數(shù)次，過蒸餾水，晾干，包裝并高壓滅菌后，便可使用。
（二）消毒
1．物理消毒法
(1)紫外線消毒 用于消毒空氣、操作臺面和一些不能用干熱、濕熱滅菌的培養(yǎng)器皿，如塑料培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板等。這是常使用的消毒方法之一。
(2)干熱滅菌 主要用于玻璃器皿的滅菌。將用于細胞培養(yǎng)的器皿放人干燥箱內(nèi)，加熱**160℃，保溫90－120 min。用于RNA提取實驗的用品則需180℃，保溫5－8 h。
(3)濕熱滅菌 此方法也稱為高壓蒸汽滅菌，是**有效的一種滅菌方法。主要應(yīng)用范圍是布類、橡膠制品(如膠塞)、金屬器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加熱后不發(fā)生沉淀的無機溶液(如Hanks液、PBS、20×SSC等)。
(4)濾過除菌 用于培養(yǎng)用液和各種不能高壓滅菌的溶液的滅菌。采用金屬濾器和小型的塑料濾器，配上可以更換的微孔濾膜，極大地方便了操作。濾器型號按直徑大小劃分。如過濾量大的培養(yǎng)用液常用較大型號的金屬濾器(直徑90 mm、100 mm、142 mm……等)，配以過濾泵使用。過濾量較小的液體常用注射器推動的塑料小濾器(直徑20 mm、25 mm等)。濾膜孔徑有0．60 μm、0．45 μm、0．35 μm、0．22 μm、0．10μm等，以0．22 μm除菌**為保險，但對于較粘稠難濾過的液體，仍需選用孔徑較大的濾膜。
2．化學消毒法
常用的消毒液有如下幾種：
(1)70％(或75％)酒精：超凈臺里常備70％酒精棉球(衛(wèi)生級酒精)，用于手和一些金屬器械或工作臺面的消毒。
(2)0．1％新潔爾滅：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超凈臺面的清潔。超凈臺旁應(yīng)常備盛有0．1％新潔爾滅溶液的容器及紗布。
(3)來蘇兒水(煤酚皂溶液)：主要用于無菌室桌椅、墻壁、地面的消毒和清洗，以及空氣噴撒消毒，特別是污染細胞的消毒處理。使用濃度請按瓶上說明。
(4)0．5％過氧乙酸：是強效消毒劑，10 min即可將芽孢菌殺死。用于各種物品的表面消毒，用噴撒和擦拭方式進行。
(5)乳酸蒸氣：將乳酸放入坩鍋內(nèi)用酒精燈或電爐加熱**沸騰為止。將門窗緊閉1—3 d?？蓪⒖諝庵衅〉奈⑸餁⑺馈?br /> (6)37％甲醛加高錳酸鉀：使用前先緊閉門窗。將37％甲醛用酒精燈或電爐加熱**沸騰后斷電或滅火。用一張紙盛好適量的高錳酸鉀，迅速放人已加熱好的甲醛中形成蒸氣。1—3 d后方可達到消毒空氣的目的。
3．煮沸消毒 急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15 min后使用。
五、注意事項
1．清洗玻璃制品時，浸酸之后一定要用自來水沖洗10—15次。因為殘存的洗液對細胞粘附有很大影響。清洗塑料制品時要用棉花或柔軟紗布擦洗。千萬不要用硬毛刷，否則損害塑料表面后細胞不易貼壁。Tip和Tube一定要用超聲清洗處理后逐個清洗。如沒有洗凈會影響下一次使用的效果。
2．干熱滅菌時，應(yīng)在白天使用烤箱，并不斷觀察，以免發(fā)生意外。當溫度超過100℃時，不能再打開烤箱門。器皿烤完后，待溫度降**100℃之下才能開烤箱門。金屬器械和橡膠、塑料制品不能使用干熱滅菌方法。．#p#分頁標題#e#
3．高壓滅菌后器皿務(wù)必晾干或烘干，以防包裝紙潮濕發(fā)霉。
4．牛血清、大部分培養(yǎng)基、胰酶和一些生物制劑是有機溶液，均不能高壓(如TdR，秋水仙素，谷氨酰胺，異硫氰酸胍，MOPS等)。
5．濾過除菌時，濾器在使用前先裝好濾膜(有時可在上面加一層定性濾紙)，包好，經(jīng)高壓滅菌后才能使用。濾過酶類制劑時應(yīng)待濾器溫度降**室溫下再進行。過濾時壓力不宜過大，壓力數(shù)字以2為宜。壓力太大時微孔濾膜可能破裂，或使某些微生物變形而通過濾膜。裝濾膜時位置要準確。另外濾器包裝時，螺釘不要擰得太緊，以防高壓蒸汽不能進入，待高壓滅菌之后，再擰緊使用。
6．使用化學消毒法時，配制75％酒精應(yīng)用衛(wèi)生級，不要用化學純、分析純和優(yōu)質(zhì)純酒精。來蘇兒水不能用于皮膚消毒，它對皮膚有刺激性。空氣消毒時，所有的物品要事先準備齊全并使消毒者有較方便的退出途徑。因為甲醛或乳酸加熱后放出的蒸氣對人的角膜和呼吸道上皮有嚴重的刺激和傷害作用。
實驗二、原代培養(yǎng)
原理 將動物機體的各種組織從機體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。     
儀器、材料及試劑 ：培養(yǎng)箱（調(diào)整**37℃），培養(yǎng)瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、紗布、手術(shù)器械、血球計數(shù)板、離心機、水浴箱（37℃） 材料：動物組織塊   試劑：1640培養(yǎng)基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒
實驗步驟
1. 準備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺面，紫外線消毒20分鐘。開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手**肘部。
2. 布局：點燃酒精燈，安裝吸管帽。
3. 處理組織：把組織塊置于燒杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60分鐘。
4. 剪切：用眼科剪把組織切成2~3毫米大小的塊，以便于消化。加入比組織塊總量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結(jié)扎瓶口或塞以膠塞。
5. 消化：或用恒溫水浴，或置于37℃溫箱消化均可，消化中每隔20分鐘應(yīng)搖動一次，如用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定。
6. 分離：在消化過程中見消化液發(fā)混濁時，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細胞團或單個細胞，立即終止消化，隨即通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊。低速（500~1000轉(zhuǎn)/分）離心消化液5分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養(yǎng)液。
7. 計數(shù)：用計數(shù)板計數(shù)，如細胞懸液細胞密度過大，再補加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝入培養(yǎng)瓶中。對大多數(shù)細胞來說，pH要求在7.2~7.4范圍，培養(yǎng)液呈微紅色，如顏色偏黃，說明液體變酸，可用NaHCO3調(diào)整。
8. 培養(yǎng)：置于36.5℃溫箱培養(yǎng)，如用CO2溫箱培養(yǎng)，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽堵塞，紗布塞易生霉菌，每次換液時需要換新塞。
初代組織塊培養(yǎng)法
1. 剪切：把組織小塊置于小燒杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸靜Hanks液，用眼科剪反復剪切1mm3塊為止。
2. 擺布：用彎頭吸管吸取若干小塊，置于培養(yǎng)瓶中，用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養(yǎng)瓶底部，小塊相互距離以0.5cm為宜，每一25ml培養(yǎng)瓶底可擺布20~30塊。
3. 輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，另瓶底向上，注意翻瓶時勿另組織小塊流動，塞好瓶塞，置36.5℃溫箱培養(yǎng)2小時左右（勿超過4小時），使小塊微干涸。
4. 培養(yǎng)：從微箱中取出培養(yǎng)瓶，開塞，46度斜持培養(yǎng)瓶，箱瓶底腳部輕輕注入培養(yǎng)液少許，然后緩緩再把培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來，讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶地上的組織小塊。置溫箱中靜止培養(yǎng)。待細胞從組織塊游出數(shù)量增多后。再補加培養(yǎng)液。
實驗三、傳代培養(yǎng)法
原理 細胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細胞能繼續(xù)生長，同時
也將細胞數(shù)量擴大，就必須進行傳代（再培養(yǎng)）。 傳代培養(yǎng)也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經(jīng)過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經(jīng)消化后才能分瓶。
實驗材料與試劑  
（1）材料： 原代培養(yǎng)細胞。
（2）設(shè)備與用品：倒置顯微鏡，CO2培養(yǎng)箱，超凈工作臺，高壓滅菌鍋，過濾器及0.22μm的水相濾膜，細胞培養(yǎng)瓶，移液管，吸管，小試管，酒精燈，試管架等。
（3）藥品與試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基；小牛血清； 0.25%胰蛋白酶（w/v, PBS緩沖液或D-Hanks緩沖液配制，pH7.4）。
l 強酸洗液的配制：先用約200mL蒸餾水充分加熱溶解重鉻酸鉀63克，再緩緩加入1L濃硫酸并不斷攪拌，充分混合溶解。洗液腐蝕性較強，操作時注意做好各方面的防護，并且動作要輕柔，注意安全。當洗液的顏色由棕紅色變?yōu)榫G色時表明已經(jīng)失效，需重新配制。
4. 實驗方法與步驟
l 實驗內(nèi)容：體外培養(yǎng)細胞的觀察及細胞的傳代培養(yǎng)。
（1） 培養(yǎng)基等的配制及實驗用品的清洗與消毒
配制RPMI-1640培養(yǎng)基及0.25%胰蛋白酶（w/v, PBS緩沖液配制pH7.4）溶液，并過濾除菌后培養(yǎng)驗菌。清洗，包裝并高壓滅菌細胞培養(yǎng)的玻璃用品等。細胞培養(yǎng)的玻璃器皿等進行初步清洗后要用強酸洗液浸泡過夜，然后用蒸餾水徹底沖洗干凈；進行濕熱滅菌時一般需**少滅菌40分鐘；培養(yǎng)過污染細胞的培養(yǎng)瓶則**好加上用煤酚皂溶液浸泡過夜的步驟；移液管和吸管在包裝前要在其管口用細絲或鑷子塞上少許棉花，長約1~1.5cm，松緊要適宜。#p#分頁標題#e#
（2）動物培養(yǎng)細胞的形態(tài)觀察
倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細胞的長勢及密度，根據(jù)細胞密度決定傳代的稀釋倍數(shù)。同時可對比觀察教師事先準備的污染細胞、死亡細胞，并對培養(yǎng)細胞的密度有一定感性的認識。
（3）消化：倒掉舊培養(yǎng)基，加幾滴胰酶潤洗一下，立即倒掉，再加適量胰酶消化1~2分鐘左右，可鏡下觀察待細胞胞質(zhì)回縮，細胞間空隙變大時立即停止消化。
（4）懸浮細胞：沿著培養(yǎng)瓶無細胞的一面倒掉胰酶，加適量培養(yǎng)基，用吸管充分吹打后，鏡下觀察是否還有貼壁細胞。
（5）分裝：一般以1：2或1：3進行分裝，即一瓶細胞可傳為2~3瓶。向分裝好的各瓶細胞中再加入適量的含10%（v/v）血清的RMBI-1640培養(yǎng)液。
（6）擰上蓋子（勿擰緊），做好標記，將培養(yǎng)瓶平放于培養(yǎng)箱中，于 37℃，5%CO2下培養(yǎng)。
5. 實驗注意事項
（1）要保證實驗中的無菌操作，就必須特別注意一些操作上的細節(jié)，比如：培養(yǎng)液等不要過早開瓶；加液時取液用的移液管、吸管勿碰用過的培養(yǎng)瓶瓶口；要勤過火焰，尤其是瓶口；手要握在移液器刻度之上的位置；超凈臺中物品的擺放要合理，盡量避免雙手交叉取物；若有動作失誤，勿存僥幸心理，應(yīng)及時更換移液管等。
（2）對于貼壁細胞的傳代培養(yǎng)胰酶的消化步驟是關(guān)鍵，要注意胰酶消化的時間也不能過長，否則不但造成細胞數(shù)目的損失，也會對細胞造成損傷，使細胞不易貼壁生長。
（3）可根據(jù)細胞的密度，生長速度及實驗周期的要求等適當調(diào)整細胞的接種密度。但細胞若接種密度過低，也會造成細胞生長極為緩慢甚**停止生長。