實驗：細胞培養
　　1.實驗目的
　　初步掌握哺乳動物細胞的原代培養與傳代培養的基本操作過程，為生物工程在醫學上的應用打下基礎。
　　2.實驗原理
　　從生物體中取出某種組織或細胞，模擬體內生理條件，在人工培養條件下使其生存、生長、繁殖或傳代，這一過程稱為細胞培養。細胞培養技術的**大優點是使我們得以直接觀察活細胞，并在有控制的環境條件下進行實驗，避免了體內實驗時的許多復雜因素，還可以與體內實驗互為補充，可同時提供大量生物性狀相同的細胞作為研究對象，耗費少，比較經濟，因此成為生物學研究的重要手段。近年來，在體細胞遺傳、分化、胚胎發生、腫瘤發生、免疫學、細胞工程、放射生物學以及老年學等一系列的研究*域中得到廣泛的應用，并取得了豐碩的成果。
　　細胞培養可分為原代培養和傳代(繼代)培養。直接從體內獲取的組織細胞進行**培養為原代培養；當原代培養的細胞增殖達到一定密度后，則需要做再培養，即將培養的細胞分散后，從一個容器以1：2或其他比率轉移到另一個或幾個容器中擴大培養，為傳代培養，傳代培養的累積次數就是細胞的代數。
　　細胞培養是一種程序復雜、要求條件多而嚴格的實驗性工作。所有離體細胞的生長都受溫度、滲透壓、pH值、無機鹽影響，消毒、配液等均有嚴格的規范和要求，特別是無菌操作是細胞培養成敗的關鍵。
　　3.實驗用品
　　3.1 材料和標本  乳兔、HeLa細胞(人宮頸癌細胞)
　　3.2 器材和儀器  手術器械、平皿、培養瓶、吸管、離心管(滅菌后備用)、酒精燈、燒杯、超凈工作臺、二氧化碳培養箱、倒置顯微鏡。
　　2.3 試劑  含有5％小牛血清的MEM培養液、0.01mol／L  PBS，0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液、75％乙醇。
　　4.實驗方法
　　4.1 原代細胞培養
　　4.1.1 原理
　　細胞培養(Cell culture)是模擬機體內生理條件，將細胞從機體中取出，在人工條件下使其生存、生長、繁殖和傳代，進行細胞生命過程、細胞癌變、細胞工程等問題的研究。近年來，廣泛地應用于分子生物學、遺傳學、免疫學、腫瘤學、細胞工程等*域，發展成一種重要生物技術，并取得顯著成就。由體內直接取出組織或細胞進行培養叫原代培養。原代培養細胞離體時間短，性狀與體內相似，適用于研究。一般說來，幼稚狀態的組織和細胞，如：動物的胚胎、幼仔的臟器等更容易進行原代培養。
　　4.1.2 操作
　　①．取材
　　用頸椎脫位法使乳兔迅速死亡。然后，把整個動物浸入盛有75％乙醇的燒杯中數秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用消過毒的剪刀剪開用碘酒和乙醇再次消毒后的皮膚，剖腹取出肝臟或腎臟。置于無菌平皿中。
　?、冢懈?br /> 　　用滅菌的PBS液將取出的臟器清洗三次，然后用眼科手術剪刀仔細將組織反復剪碎，直到成1mm3左右的小塊，再用PBS清洗，洗到組織塊發白為止。移入無菌離心管中，靜置數分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清。
　?、郏⒔臃N培養
　　吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液1ml，加入離心管中，與組織塊混勻后，加上管口塞子，37℃水浴中消化8～10分鐘，每隔幾分鐘搖動一下試管，使組織與消化液充分接觸，靜止，吸去上清，向離心管中加入5～10ml含5％小牛血清的MEM培養基，用吸管吹打混勻，移入二個培養瓶中，置于二氧化碳培養箱中培養。
　　4.1.3 結果
　　細胞接種后一般幾小時內就能貼壁，并開始生長，如接種的細胞密度適宜，5天到一周即可形成單層。
　　4.2 傳代細胞培養
　　4.2.1 原理
　　體外培養的原代細胞或細胞株要在體外持續地培養就必須傳代，以便獲得穩定的細胞株或得到大量的同種細胞，并維持細胞種的延續。培養的細胞形成單層匯合以后，由于密度過大生存空間不足而引起營養枯竭，將培養的細胞分散，從容器中取出，以1:2或l:3以上的比率轉移到另外的容器中進行培養，即為傳代培養。
　　細胞“一代”指從細胞接種到分離再培養的一段期間，與細胞世代或倍增不同。在一代中，細胞培增3～6次。細胞傳代后，一般經過三個階段：游離期、指數增生期和停止期。
　　常用細胞分裂指數表示細胞增殖的旺盛程度，即細胞群的分裂相數／100個細胞。一般細胞分裂指數介于0.2％～0.5％，腫瘤細胞可達3～5％。細胞接種2～3天分裂增殖旺盛，是活力**好時期，稱指數增生期(對數生長期)，適宜進行各種試驗。
　　4.2.2 操作
　?、伲畬㈤L成單層的原代培養細胞或HeLa細胞從二氧化碳培養箱中取出，在超凈工作臺中倒掉瓶內的培養液，加入少許消化液。(以液面蓋住細胞為宜)，靜置5～10分鐘。
　　②.在倒置鏡下觀察被消化的細胞，如果細胞變園，相互之間不再連接成片，這時應立即
　　在超凈臺中將消化液倒掉，加入3～5ml新鮮培養液，吹打，制成細胞懸液。
　　③．將細胞懸液吸出2ml左右，加到另一個培養瓶中并向每個瓶中分別加3ml左右培養液，蓋好瓶塞，送回二氧化碳培養箱中，繼續進行培養。
　　4.2.3 結果
　　一般情況，傳代后的細胞在2小時左右就能附著在培養瓶壁上，2～4天就可在瓶內形成單層，需要再次進行傳代。#p#分頁標題#e#
　　4.3 器材及液體的準備和無菌操作的注意事項
　　4.3.1 器材和液體的準備
　　細胞培養用的玻璃器材，如：培養瓶、吸管等在清洗干凈以后，裝在鋁盒和鐵筒中，120℃，2小時干烤滅菌后備用；手術器材、瓶塞、配制好的PBS液用滅菌鍋15磅，20分鐘蒸氣滅菌；MEM培養液、小牛血清、消化液用G6濾器負壓抽濾后備用。
　　4.3.2 無菌操作中的注意事項
　　在無菌操作中，一定要保持工作區的無菌清潔。為此，在操作前要認真地洗手并用75％乙醇消毒。操作前20～30分鐘起動超凈臺吹風。操作時，嚴禁說話，嚴禁用手直接拿無菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血鉗、鑷子等去拿。培養瓶要在超凈臺內才能打開瓶塞，打開之前用乙醇將瓶口消毒，打開后和加塞前瓶口都要在酒精燈上燒一下，打開瓶口后的操作全部都要在超凈臺內完成。操作完畢后，加上瓶塞，才能拿到超凈臺外。使用的吸管在從消毒的鐵筒中取出后要手拿末端，將**在火上燒一下，戴上膠皮乳頭，然后再去吸取液體?？傊谡麄€無菌操作過程中都應該在酒精燈的周圍進行。
　　5．實驗報告
　　(1).原代細胞和傳代細胞培養有哪些區別?
　　(2).總結一下你自己的經驗，怎樣才能既迅速，又保證無菌操作。
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2008-09-13 10:24 200602115 | 五級
細胞培養
1.實驗目的
初步掌握哺乳動物細胞的原代培養與傳代培養的基本操作過程，為生物工程在醫學上的應用打下基礎。
2.實驗原理
從生物體中取出某種組織或細胞，模擬體內生理條件，在人工培養條件下使其生存、生長、繁殖或傳代，這一過程稱為細胞培養。細胞培養技術的**大優點是使我們得以直接觀察活細胞，并在有控制的環境條件下進行實驗，避免了體內實驗時的許多復雜因素，還可以與體內實驗互為補充，可同時提供大量生物性狀相同的細胞作為研究對象，耗費少，比較經濟，因此成為生物學研究的重要手段。近年來，在體細胞遺傳、分化、胚胎發生、腫瘤發生、免疫學、細胞工程、放射生物學以及老年學等一系列的研究*域中得到廣泛的應用，并取得了豐碩的成果。
細胞培養可分為原代培養和傳代(繼代)培養。直接從體內獲取的組織細胞進行**培養為原代培養；當原代培養的細胞增殖達到一定密度后，則需要做再培養，即將培養的細胞分散后，從一個容器以1：2或其他比率轉移到另一個或幾個容器中擴大培養，為傳代培養，傳代培養的累積次數就是細胞的代數。
細胞培養是一種程序復雜、要求條件多而嚴格的實驗性工作。所有離體細胞的生長都受溫度、滲透壓、pH值、無機鹽影響，消毒、配液等均有嚴格的規范和要求，特別是無菌操作是細胞培養成敗的關鍵。
3.實驗用品
3.1 材料和標本 乳兔、HeLa細胞(人宮頸癌細胞)
3.2 器材和儀器 手術器械、平皿、培養瓶、吸管、離心管(滅菌后備用)、酒精燈、燒杯、超凈工作臺、二氧化碳培養箱、倒置顯微鏡。
2.3 試劑 含有5％小牛血清的MEM培養液、0.01mol／L PBS，0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液、75％乙醇。
4.實驗方法
4.1 原代細胞培養
4.1.1 原理
細胞培養(Cell culture)是模擬機體內生理條件，將細胞從機體中取出，在人工條件下使其生存、生長、繁殖和傳代，進行細胞生命過程、細胞癌變、細胞工程等問題的研究。近年來，廣泛地應用于分子生物學、遺傳學、免疫學、腫瘤學、細胞工程等*域，發展成一種重要生物技術，并取得顯著成就。由體內直接取出組織或細胞進行培養叫原代培養。原代培養細胞離體時間短，性狀與體內相似，適用于研究。一般說來，幼稚狀態的組織和細胞，如：動物的胚胎、幼仔的臟器等更容易進行原代培養。
4.1.2 操作
①．取材
用頸椎脫位法使乳兔迅速死亡。然后，把整個動物浸入盛有75％乙醇的燒杯中數秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用消過毒的剪刀剪開用碘酒和乙醇再次消毒后的皮膚，剖腹取出肝臟或腎臟。置于無菌平皿中。#p#分頁標題#e#
②．切割
用滅菌的PBS液將取出的臟器清洗三次，然后用眼科手術剪刀仔細將組織反復剪碎，直到成1mm3左右的小塊，再用PBS清洗，洗到組織塊發白為止。移入無菌離心管中，靜置數分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清。
③．消化、接種培養
吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液1ml，加入離心管中，與組織塊混勻后，加上管口塞子，37℃水浴中消化8～10分鐘，每隔幾分鐘搖動一下試管，使組織與消化液充分接觸，靜止，吸去上清，向離心管中加入5～10ml含5％小牛血清的MEM培養基，用吸管吹打混勻，移入二個培養瓶中，置于二氧化碳培養箱中培養。
4.1.3 結果
細胞接種后一般幾小時內就能貼壁，并開始生長，如接種的細胞密度適宜，5天到一周即可形成單層。
4.2 傳代細胞培養
4.2.1 原理
體外培養的原代細胞或細胞株要在體外持續地培養就必須傳代，以便獲得穩定的細胞株或得到大量的同種細胞，并維持細胞種的延續。培養的細胞形成單層匯合以后，由于密度過大生存空間不足而引起營養枯竭，將培養的細胞分散，從容器中取出，以1:2或l:3以上的比率轉移到另外的容器中進行培養，即為傳代培養。
細胞“一代”指從細胞接種到分離再培養的一段期間，與細胞世代或倍增不同。在一代中，細胞培增3～6次。細胞傳代后，一般經過三個階段：游離期、指數增生期和停止期。
常用細胞分裂指數表示細胞增殖的旺盛程度，即細胞群的分裂相數／100個細胞。一般細胞分裂指數介于0.2％～0.5％，腫瘤細胞可達3～5％。細胞接種2～3天分裂增殖旺盛，是活力**好時期，稱指數增生期(對數生長期)，適宜進行各種試驗。
4.2.2 操作
①．將長成單層的原代培養細胞或HeLa細胞從二氧化碳培養箱中取出，在超凈工作臺中倒掉瓶內的培養液，加入少許消化液。(以液面蓋住細胞為宜)，靜置5～10分鐘。
②.在倒置鏡下觀察被消化的細胞，如果細胞變園，相互之間不再連接成片，這時應立即
在超凈臺中將消化液倒掉，加入3～5ml新鮮培養液，吹打，制成細胞懸液。
③．將細胞懸液吸出2ml左右，加到另一個培養瓶中并向每個瓶中分別加3ml左右培養液，蓋好瓶塞，送回二氧化碳培養箱中，繼續進行培養。
4.2.3 結果
一般情況，傳代后的細胞在2小時左右就能附著在培養瓶壁上，2～4天就可在瓶內形成單層，需要再次進行傳代。
4.3 器材及液體的準備和無菌操作的注意事項
4.3.1 器材和液體的準備
細胞培養用的玻璃器材，如：培養瓶、吸管等在清洗干凈以后，裝在鋁盒和鐵筒中，120℃，2小時干烤滅菌后備用；手術器材、瓶塞、配制好的PBS液用滅菌鍋15磅，20分鐘蒸氣滅菌；MEM培養液、小牛血清、消化液用G6濾器負壓抽濾后備用。
4.3.2 無菌操作中的注意事項
在無菌操作中，一定要保持工作區的無菌清潔。為此，在操作前要認真地洗手并用75％乙醇消毒。操作前20～30分鐘起動超凈臺吹風。操作時，嚴禁說話，嚴禁用手直接拿無菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血鉗、鑷子等去拿。培養瓶要在超凈臺內才能打開瓶塞，打開之前用乙醇將瓶口消毒，打開后和加塞前瓶口都要在酒精燈上燒一下，打開瓶口后的操作全部都要在超凈臺內完成。操作完畢后，加上瓶塞，才能拿到超凈臺外。使用的吸管在從消毒的鐵筒中取出后要手拿末端，將**在火上燒一下，戴上膠皮乳頭，然后再去吸取液體。總之，在整個無菌操作過程中都應該在酒精燈的周圍進行。
5．實驗報告
(1).原代細胞和傳代細胞培養有哪些區別?
(2).總結一下你自己的經驗，怎樣才能既迅速，又保證無菌操作。 細胞培養
1.實驗目的
初步掌握哺乳動物細胞的原代培養與傳代培養的基本操作過程，為生物工程在醫學上的應用打下基礎。
2.實驗原理
從生物體中取出某種組織或細胞，模擬體內生理條件，在人工培養條件下使其生存、生長、繁殖或傳代，這一過程稱為細胞培養。細胞培養技術的**大優點是使我們得以直接觀察活細胞，并在有控制的環境條件下進行實驗，避免了體內實驗時的許多復雜因素，還可以與體內實驗互為補充，可同時提供大量生物性狀相同的細胞作為研究對象，耗費少，比較經濟，因此成為生物學研究的重要手段。近年來，在體細胞遺傳、分化、胚胎發生、腫瘤發生、免疫學、細胞工程、放射生物學以及老年學等一系列的研究*域中得到廣泛的應用，并取得了豐碩的成果。
細胞培養可分為原代培養和傳代(繼代)培養。直接從體內獲取的組織細胞進行**培養為原代培養；當原代培養的細胞增殖達到一定密度后，則需要做再培養，即將培養的細胞分散后，從一個容器以1：2或其他比率轉移到另一個或幾個容器中擴大培養，為傳代培養，傳代培養的累積次數就是細胞的代數。
細胞培養是一種程序復雜、要求條件多而嚴格的實驗性工作。所有離體細胞的生長都受溫度、滲透壓、pH值、無機鹽影響，消毒、配液等均有嚴格的規范和要求，特別是無菌操作是細胞培養成敗的關鍵。
3.實驗用品
3.1 材料和標本 乳兔、HeLa細胞(人宮頸癌細胞)
3.2 器材和儀器 手術器械、平皿、培養瓶、吸管、離心管(滅菌后備用)、酒精燈、燒杯、超凈工作臺、二氧化碳培養箱、倒置顯微鏡。#p#分頁標題#e#
2.3 試劑 含有5％小牛血清的MEM培養液、0.01mol／L PBS，0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液、75％乙醇。
4.實驗方法
4.1 原代細胞培養
4.1.1 原理
細胞培養(Cell culture)是模擬機體內生理條件，將細胞從機體中取出，在人工條件下使其生存、生長、繁殖和傳代，進行細胞生命過程、細胞癌變、細胞工程等問題的研究。近年來，廣泛地應用于分子生物學、遺傳學、免疫學、腫瘤學、細胞工程等*域，發展成一種重要生物技術，并取得顯著成就。由體內直接取出組織或細胞進行培養叫原代培養。原代培養細胞離體時間短，性狀與體內相似，適用于研究。一般說來，幼稚狀態的組織和細胞，如：動物的胚胎、幼仔的臟器等更容易進行原代培養。
4.1.2 操作
①．取材
用頸椎脫位法使乳兔迅速死亡。然后，把整個動物浸入盛有75％乙醇的燒杯中數秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用消過毒的剪刀剪開用碘酒和乙醇再次消毒后的皮膚，剖腹取出肝臟或腎臟。置于無菌平皿中。
②．切割
用滅菌的PBS液將取出的臟器清洗三次，然后用眼科手術剪刀仔細將組織反復剪碎，直到成1mm3左右的小塊，再用PBS清洗，洗到組織塊發白為止。移入無菌離心管中，靜置數分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清。
③．消化、接種培養
吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液1ml，加入離心管中，與組織塊混勻后，加上管口塞子，37℃水浴中消化8～10分鐘，每隔幾分鐘搖動一下試管，使組織與消化液充分接觸，靜止，吸去上清，向離心管中加入5～10ml含5％小牛血清的MEM培養基，用吸管吹打混勻，移入二個培養瓶中，置于二氧化碳培養箱中培養。
4.1.3 結果
細胞接種后一般幾小時內就能貼壁，并開始生長，如接種的細胞密度適宜，5天到一周即可形成單層。
4.2 傳代細胞培養
4.2.1 原理
體外培養的原代細胞或細胞株要在體外持續地培養就必須傳代，以便獲得穩定的細胞株或得到大量的同種細胞，并維持細胞種的延續。培養的細胞形成單層匯合以后，由于密度過大生存空間不足而引起營養枯竭，將培養的細胞分散，從容器中取出，以1:2或l:3以上的比率轉移到另外的容器中進行培養，即為傳代培養。
細胞“一代”指從細胞接種到分離再培養的一段期間，與細胞世代或倍增不同。在一代中，細胞培增3～6次。細胞傳代后，一般經過三個階段：游離期、指數增生期和停止期。
常用細胞分裂指數表示細胞增殖的旺盛程度，即細胞群的分裂相數／100個細胞。一般細胞分裂指數介于0.2％～0.5％，腫瘤細胞可達3～5％。細胞接種2～3天分裂增殖旺盛，是活力**好時期，稱指數增生期(對數生長期)，適宜進行各種試驗。
4.2.2 操作
①．將長成單層的原代培養細胞或HeLa細胞從二氧化碳培養箱中取出，在超凈工作臺中倒掉瓶內的培養液，加入少許消化液。(以液面蓋住細胞為宜)，靜置5～10分鐘。
②.在倒置鏡下觀察被消化的細胞，如果細胞變園，相互之間不再連接成片，這時應立即
在超凈臺中將消化液倒掉，加入3～5ml新鮮培養液，吹打，制成細胞懸液。
③．將細胞懸液吸出2ml左右，加到另一個培養瓶中并向每個瓶中分別加3ml左右培養液，蓋好瓶塞，送回二氧化碳培養箱中，繼續進行培養。
4.2.3 結果
一般情況，傳代后的細胞在2小時左右就能附著在培養瓶壁上，2～4天就可在瓶內形成單層，需要再次進行傳代。
4.3 器材及液體的準備和無菌操作的注意事項
4.3.1 器材和液體的準備
細胞培養用的玻璃器材，如：培養瓶、吸管等在清洗干凈以后，裝在鋁盒和鐵筒中，120℃，2小時干烤滅菌后備用；手術器材、瓶塞、配制好的PBS液用滅菌鍋15磅，20分鐘蒸氣滅菌；MEM培養液、小牛血清、消化液用G6濾器負壓抽濾后備用。
4.3.2 無菌操作中的注意事項
在無菌操作中，一定要保持工作區的無菌清潔。為此，在操作前要認真地洗手并用75％乙醇消毒。操作前20～30分鐘起動超凈臺吹風。操作時，嚴禁說話，嚴禁用手直接拿無菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血鉗、鑷子等去拿。培養瓶要在超凈臺內才能打開瓶塞，打開之前用乙醇將瓶口消毒，打開后和加塞前瓶口都要在酒精燈上燒一下，打開瓶口后的操作全部都要在超凈臺內完成。操作完畢后，加上瓶塞，才能拿到超凈臺外。使用的吸管在從消毒的鐵筒中取出后要手拿末端，將**在火上燒一下，戴上膠皮乳頭，然后再去吸取液體?？傊?，在整個無菌操作過程中都應該在酒精燈的周圍進行。
5．實驗報告
(1).原代細胞和傳代細胞培養有哪些區別?
(2).總結一下你自己的經驗，怎樣才能既迅速，又保證無菌操作。