實驗:細胞培養
1.實驗目的
初步掌握哺乳動物細胞的原代培養與傳代培養的基本操作過程,為生物工程在醫學上的應用打下基礎。
2.實驗原理
從生物體中取出某種組織或細胞,模擬體內生理條件,在人工培養條件下使其生存、生長、繁殖或傳代,這一過程稱為細胞培養。細胞培養技術的**大優點是使我們得以直接觀察活細胞,并在有控制的環境條件下進行實驗,避免了體內實驗時的許多復雜因素,還可以與體內實驗互為補充,可同時提供大量生物性狀相同的細胞作為研究對象,耗費少,比較經濟,因此成為生物學研究的重要手段。近年來,在體細胞遺傳、分化、胚胎發生、腫瘤發生、免疫學、細胞工程、放射生物學以及老年學等一系列的研究*域中得到廣泛的應用,并取得了豐碩的成果。
細胞培養可分為原代培養和傳代(繼代)培養。直接從體內獲取的組織細胞進行**培養為原代培養;當原代培養的細胞增殖達到一定密度后,則需要做再培養,即將培養的細胞分散后,從一個容器以1:2或其他比率轉移到另一個或幾個容器中擴大培養,為傳代培養,傳代培養的累積次數就是細胞的代數。
細胞培養是一種程序復雜、要求條件多而嚴格的實驗性工作。所有離體細胞的生長都受溫度、滲透壓、pH值、無機鹽影響,消毒、配液等均有嚴格的規范和要求,特別是無菌操作是細胞培養成敗的關鍵。
3.實驗用品
3.1 材料和標本 乳兔、HeLa細胞(人宮頸癌細胞)
3.2 器材和儀器 手術器械、平皿、培養瓶、吸管、離心管(滅菌后備用)、酒精燈、燒杯、超凈工作臺、二氧化碳培養箱、倒置顯微鏡。
2.3 試劑 含有5%小牛血清的MEM培養液、0.01mol/L PBS,0.25%胰蛋白酶一0.02%EDTA混合消化液、75%乙醇。
4.實驗方法
4.1 原代細胞培養
4.1.1 原理
細胞培養(Cell culture)是模擬機體內生理條件,將細胞從機體中取出,在人工條件下使其生存、生長、繁殖和傳代,進行細胞生命過程、細胞癌變、細胞工程等問題的研究。近年來,廣泛地應用于分子生物學、遺傳學、免疫學、腫瘤學、細胞工程等*域,發展成一種重要生物技術,并取得顯著成就。由體內直接取出組織或細胞進行培養叫原代培養。原代培養細胞離體時間短,性狀與體內相似,適用于研究。一般說來,幼稚狀態的組織和細胞,如:動物的胚胎、幼仔的臟器等更容易進行原代培養。
4.1.2 操作
①.取材
用頸椎脫位法使乳兔迅速死亡。然后,把整個動物浸入盛有75%乙醇的燒杯中數秒鐘消毒,取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用消過毒的剪刀剪開用碘酒和乙醇再次消毒后的皮膚,剖腹取出肝臟或腎臟。置于無菌平皿中。
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用滅菌的PBS液將取出的臟器清洗三次,然后用眼科手術剪刀仔細將組織反復剪碎,直到成1mm3左右的小塊,再用PBS清洗,洗到組織塊發白為止。移入無菌離心管中,靜置數分鐘,使組織塊自然沉淀到管底,棄去上清。
?、郏⒔臃N培養
吸取0.25%胰蛋白酶一0.02%EDTA混合消化液1ml,加入離心管中,與組織塊混勻后,加上管口塞子,37℃水浴中消化8~10分鐘,每隔幾分鐘搖動一下試管,使組織與消化液充分接觸,靜止,吸去上清,向離心管中加入5~10ml含5%小牛血清的MEM培養基,用吸管吹打混勻,移入二個培養瓶中,置于二氧化碳培養箱中培養。
4.1.3 結果
細胞接種后一般幾小時內就能貼壁,并開始生長,如接種的細胞密度適宜,5天到一周即可形成單層。
4.2 傳代細胞培養
4.2.1 原理
體外培養的原代細胞或細胞株要在體外持續地培養就必須傳代,以便獲得穩定的細胞株或得到大量的同種細胞,并維持細胞種的延續。培養的細胞形成單層匯合以后,由于密度過大生存空間不足而引起營養枯竭,將培養的細胞分散,從容器中取出,以1:2或l:3以上的比率轉移到另外的容器中進行培養,即為傳代培養。
細胞“一代”指從細胞接種到分離再培養的一段期間,與細胞世代或倍增不同。在一代中,細胞培增3~6次。細胞傳代后,一般經過三個階段:游離期、指數增生期和停止期。
常用細胞分裂指數表示細胞增殖的旺盛程度,即細胞群的分裂相數/100個細胞。一般細胞分裂指數介于0.2%~0.5%,腫瘤細胞可達3~5%。細胞接種2~3天分裂增殖旺盛,是活力**好時期,稱指數增生期(對數生長期),適宜進行各種試驗。
4.2.2 操作
?、伲畬㈤L成單層的原代培養細胞或HeLa細胞從二氧化碳培養箱中取出,在超凈工作臺中倒掉瓶內的培養液,加入少許消化液。(以液面蓋住細胞為宜),靜置5~10分鐘。
②.在倒置鏡下觀察被消化的細胞,如果細胞變園,相互之間不再連接成片,這時應立即
在超凈臺中將消化液倒掉,加入3~5ml新鮮培養液,吹打,制成細胞懸液。
③.將細胞懸液吸出2ml左右,加到另一個培養瓶中并向每個瓶中分別加3ml左右培養液,蓋好瓶塞,送回二氧化碳培養箱中,繼續進行培養。
4.2.3 結果
一般情況,傳代后的細胞在2小時左右就能附著在培養瓶壁上,2~4天就可在瓶內形成單層,需要再次進行傳代。#p#分頁標題#e#
4.3 器材及液體的準備和無菌操作的注意事項
4.3.1 器材和液體的準備
細胞培養用的玻璃器材,如:培養瓶、吸管等在清洗干凈以后,裝在鋁盒和鐵筒中,120℃,2小時干烤滅菌后備用;手術器材、瓶塞、配制好的PBS液用滅菌鍋15磅,20分鐘蒸氣滅菌;MEM培養液、小牛血清、消化液用G6濾器負壓抽濾后備用。
4.3.2 無菌操作中的注意事項
在無菌操作中,一定要保持工作區的無菌清潔。為此,在操作前要認真地洗手并用75%乙醇消毒。操作前20~30分鐘起動超凈臺吹風。操作時,嚴禁說話,嚴禁用手直接拿無菌的物品,如瓶塞等,而要用器械,如止血鉗、鑷子等去拿。培養瓶要在超凈臺內才能打開瓶塞,打開之前用乙醇將瓶口消毒,打開后和加塞前瓶口都要在酒精燈上燒一下,打開瓶口后的操作全部都要在超凈臺內完成。操作完畢后,加上瓶塞,才能拿到超凈臺外。使用的吸管在從消毒的鐵筒中取出后要手拿末端,將**在火上燒一下,戴上膠皮乳頭,然后再去吸取液體??傊谡麄€無菌操作過程中都應該在酒精燈的周圍進行。
5.實驗報告
(1).原代細胞和傳代細胞培養有哪些區別?
(2).總結一下你自己的經驗,怎樣才能既迅速,又保證無菌操作。
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動物細胞培養:基本技術指南(第5版) 中英文版本可以也發給我一份嗎?...
2011-10-27
動物細胞培養-基本技術指南(第五版)作者:英R.I.弗雷謝尼 著,章...
2012-01-09
求動物細胞培養:基本技術指南(第5版)pdf版發給我一份嗎?nasa10...1
2012-05-16
我在尋找《動物細胞培養:基本技術指南(第五版)》.pdf,弗雷謝尼... 1
2011-12-21
求《動物細胞培養基本技術指南》第五版,弗雷謝尼著,電子版。 940... 1
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2008-09-13 10:24
200602115 | 五級
細胞培養
1.實驗目的
初步掌握哺乳動物細胞的原代培養與傳代培養的基本操作過程,為生物工程在醫學上的應用打下基礎。
2.實驗原理
從生物體中取出某種組織或細胞,模擬體內生理條件,在人工培養條件下使其生存、生長、繁殖或傳代,這一過程稱為細胞培養。細胞培養技術的**大優點是使我們得以直接觀察活細胞,并在有控制的環境條件下進行實驗,避免了體內實驗時的許多復雜因素,還可以與體內實驗互為補充,可同時提供大量生物性狀相同的細胞作為研究對象,耗費少,比較經濟,因此成為生物學研究的重要手段。近年來,在體細胞遺傳、分化、胚胎發生、腫瘤發生、免疫學、細胞工程、放射生物學以及老年學等一系列的研究*域中得到廣泛的應用,并取得了豐碩的成果。
細胞培養可分為原代培養和傳代(繼代)培養。直接從體內獲取的組織細胞進行**培養為原代培養;當原代培養的細胞增殖達到一定密度后,則需要做再培養,即將培養的細胞分散后,從一個容器以1:2或其他比率轉移到另一個或幾個容器中擴大培養,為傳代培養,傳代培養的累積次數就是細胞的代數。
細胞培養是一種程序復雜、要求條件多而嚴格的實驗性工作。所有離體細胞的生長都受溫度、滲透壓、pH值、無機鹽影響,消毒、配液等均有嚴格的規范和要求,特別是無菌操作是細胞培養成敗的關鍵。
3.實驗用品
3.1 材料和標本 乳兔、HeLa細胞(人宮頸癌細胞)
3.2 器材和儀器 手術器械、平皿、培養瓶、吸管、離心管(滅菌后備用)、酒精燈、燒杯、超凈工作臺、二氧化碳培養箱、倒置顯微鏡。
2.3 試劑 含有5%小牛血清的MEM培養液、0.01mol/L PBS,0.25%胰蛋白酶一0.02%EDTA混合消化液、75%乙醇。
4.實驗方法
4.1 原代細胞培養
4.1.1 原理
細胞培養(Cell culture)是模擬機體內生理條件,將細胞從機體中取出,在人工條件下使其生存、生長、繁殖和傳代,進行細胞生命過程、細胞癌變、細胞工程等問題的研究。近年來,廣泛地應用于分子生物學、遺傳學、免疫學、腫瘤學、細胞工程等*域,發展成一種重要生物技術,并取得顯著成就。由體內直接取出組織或細胞進行培養叫原代培養。原代培養細胞離體時間短,性狀與體內相似,適用于研究。一般說來,幼稚狀態的組織和細胞,如:動物的胚胎、幼仔的臟器等更容易進行原代培養。
4.1.2 操作
①.取材
用頸椎脫位法使乳兔迅速死亡。然后,把整個動物浸入盛有75%乙醇的燒杯中數秒鐘消毒,取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用消過毒的剪刀剪開用碘酒和乙醇再次消毒后的皮膚,剖腹取出肝臟或腎臟。置于無菌平皿中。#p#分頁標題#e#
②.切割
用滅菌的PBS液將取出的臟器清洗三次,然后用眼科手術剪刀仔細將組織反復剪碎,直到成1mm3左右的小塊,再用PBS清洗,洗到組織塊發白為止。移入無菌離心管中,靜置數分鐘,使組織塊自然沉淀到管底,棄去上清。
③.消化、接種培養
吸取0.25%胰蛋白酶一0.02%EDTA混合消化液1ml,加入離心管中,與組織塊混勻后,加上管口塞子,37℃水浴中消化8~10分鐘,每隔幾分鐘搖動一下試管,使組織與消化液充分接觸,靜止,吸去上清,向離心管中加入5~10ml含5%小牛血清的MEM培養基,用吸管吹打混勻,移入二個培養瓶中,置于二氧化碳培養箱中培養。
4.1.3 結果
細胞接種后一般幾小時內就能貼壁,并開始生長,如接種的細胞密度適宜,5天到一周即可形成單層。
4.2 傳代細胞培養
4.2.1 原理
體外培養的原代細胞或細胞株要在體外持續地培養就必須傳代,以便獲得穩定的細胞株或得到大量的同種細胞,并維持細胞種的延續。培養的細胞形成單層匯合以后,由于密度過大生存空間不足而引起營養枯竭,將培養的細胞分散,從容器中取出,以1:2或l:3以上的比率轉移到另外的容器中進行培養,即為傳代培養。
細胞“一代”指從細胞接種到分離再培養的一段期間,與細胞世代或倍增不同。在一代中,細胞培增3~6次。細胞傳代后,一般經過三個階段:游離期、指數增生期和停止期。
常用細胞分裂指數表示細胞增殖的旺盛程度,即細胞群的分裂相數/100個細胞。一般細胞分裂指數介于0.2%~0.5%,腫瘤細胞可達3~5%。細胞接種2~3天分裂增殖旺盛,是活力**好時期,稱指數增生期(對數生長期),適宜進行各種試驗。
4.2.2 操作
①.將長成單層的原代培養細胞或HeLa細胞從二氧化碳培養箱中取出,在超凈工作臺中倒掉瓶內的培養液,加入少許消化液。(以液面蓋住細胞為宜),靜置5~10分鐘。
②.在倒置鏡下觀察被消化的細胞,如果細胞變園,相互之間不再連接成片,這時應立即
在超凈臺中將消化液倒掉,加入3~5ml新鮮培養液,吹打,制成細胞懸液。
③.將細胞懸液吸出2ml左右,加到另一個培養瓶中并向每個瓶中分別加3ml左右培養液,蓋好瓶塞,送回二氧化碳培養箱中,繼續進行培養。
4.2.3 結果
一般情況,傳代后的細胞在2小時左右就能附著在培養瓶壁上,2~4天就可在瓶內形成單層,需要再次進行傳代。
4.3 器材及液體的準備和無菌操作的注意事項
4.3.1 器材和液體的準備
細胞培養用的玻璃器材,如:培養瓶、吸管等在清洗干凈以后,裝在鋁盒和鐵筒中,120℃,2小時干烤滅菌后備用;手術器材、瓶塞、配制好的PBS液用滅菌鍋15磅,20分鐘蒸氣滅菌;MEM培養液、小牛血清、消化液用G6濾器負壓抽濾后備用。
4.3.2 無菌操作中的注意事項
在無菌操作中,一定要保持工作區的無菌清潔。為此,在操作前要認真地洗手并用75%乙醇消毒。操作前20~30分鐘起動超凈臺吹風。操作時,嚴禁說話,嚴禁用手直接拿無菌的物品,如瓶塞等,而要用器械,如止血鉗、鑷子等去拿。培養瓶要在超凈臺內才能打開瓶塞,打開之前用乙醇將瓶口消毒,打開后和加塞前瓶口都要在酒精燈上燒一下,打開瓶口后的操作全部都要在超凈臺內完成。操作完畢后,加上瓶塞,才能拿到超凈臺外。使用的吸管在從消毒的鐵筒中取出后要手拿末端,將**在火上燒一下,戴上膠皮乳頭,然后再去吸取液體。總之,在整個無菌操作過程中都應該在酒精燈的周圍進行。
5.實驗報告
(1).原代細胞和傳代細胞培養有哪些區別?
(2).總結一下你自己的經驗,怎樣才能既迅速,又保證無菌操作。 細胞培養
1.實驗目的
初步掌握哺乳動物細胞的原代培養與傳代培養的基本操作過程,為生物工程在醫學上的應用打下基礎。
2.實驗原理
從生物體中取出某種組織或細胞,模擬體內生理條件,在人工培養條件下使其生存、生長、繁殖或傳代,這一過程稱為細胞培養。細胞培養技術的**大優點是使我們得以直接觀察活細胞,并在有控制的環境條件下進行實驗,避免了體內實驗時的許多復雜因素,還可以與體內實驗互為補充,可同時提供大量生物性狀相同的細胞作為研究對象,耗費少,比較經濟,因此成為生物學研究的重要手段。近年來,在體細胞遺傳、分化、胚胎發生、腫瘤發生、免疫學、細胞工程、放射生物學以及老年學等一系列的研究*域中得到廣泛的應用,并取得了豐碩的成果。
細胞培養可分為原代培養和傳代(繼代)培養。直接從體內獲取的組織細胞進行**培養為原代培養;當原代培養的細胞增殖達到一定密度后,則需要做再培養,即將培養的細胞分散后,從一個容器以1:2或其他比率轉移到另一個或幾個容器中擴大培養,為傳代培養,傳代培養的累積次數就是細胞的代數。
細胞培養是一種程序復雜、要求條件多而嚴格的實驗性工作。所有離體細胞的生長都受溫度、滲透壓、pH值、無機鹽影響,消毒、配液等均有嚴格的規范和要求,特別是無菌操作是細胞培養成敗的關鍵。
3.實驗用品
3.1 材料和標本 乳兔、HeLa細胞(人宮頸癌細胞)
3.2 器材和儀器 手術器械、平皿、培養瓶、吸管、離心管(滅菌后備用)、酒精燈、燒杯、超凈工作臺、二氧化碳培養箱、倒置顯微鏡。#p#分頁標題#e#
2.3 試劑 含有5%小牛血清的MEM培養液、0.01mol/L PBS,0.25%胰蛋白酶一0.02%EDTA混合消化液、75%乙醇。
4.實驗方法
4.1 原代細胞培養
4.1.1 原理
細胞培養(Cell culture)是模擬機體內生理條件,將細胞從機體中取出,在人工條件下使其生存、生長、繁殖和傳代,進行細胞生命過程、細胞癌變、細胞工程等問題的研究。近年來,廣泛地應用于分子生物學、遺傳學、免疫學、腫瘤學、細胞工程等*域,發展成一種重要生物技術,并取得顯著成就。由體內直接取出組織或細胞進行培養叫原代培養。原代培養細胞離體時間短,性狀與體內相似,適用于研究。一般說來,幼稚狀態的組織和細胞,如:動物的胚胎、幼仔的臟器等更容易進行原代培養。
4.1.2 操作
①.取材
用頸椎脫位法使乳兔迅速死亡。然后,把整個動物浸入盛有75%乙醇的燒杯中數秒鐘消毒,取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用消過毒的剪刀剪開用碘酒和乙醇再次消毒后的皮膚,剖腹取出肝臟或腎臟。置于無菌平皿中。
②.切割
用滅菌的PBS液將取出的臟器清洗三次,然后用眼科手術剪刀仔細將組織反復剪碎,直到成1mm3左右的小塊,再用PBS清洗,洗到組織塊發白為止。移入無菌離心管中,靜置數分鐘,使組織塊自然沉淀到管底,棄去上清。
③.消化、接種培養
吸取0.25%胰蛋白酶一0.02%EDTA混合消化液1ml,加入離心管中,與組織塊混勻后,加上管口塞子,37℃水浴中消化8~10分鐘,每隔幾分鐘搖動一下試管,使組織與消化液充分接觸,靜止,吸去上清,向離心管中加入5~10ml含5%小牛血清的MEM培養基,用吸管吹打混勻,移入二個培養瓶中,置于二氧化碳培養箱中培養。
4.1.3 結果
細胞接種后一般幾小時內就能貼壁,并開始生長,如接種的細胞密度適宜,5天到一周即可形成單層。
4.2 傳代細胞培養
4.2.1 原理
體外培養的原代細胞或細胞株要在體外持續地培養就必須傳代,以便獲得穩定的細胞株或得到大量的同種細胞,并維持細胞種的延續。培養的細胞形成單層匯合以后,由于密度過大生存空間不足而引起營養枯竭,將培養的細胞分散,從容器中取出,以1:2或l:3以上的比率轉移到另外的容器中進行培養,即為傳代培養。
細胞“一代”指從細胞接種到分離再培養的一段期間,與細胞世代或倍增不同。在一代中,細胞培增3~6次。細胞傳代后,一般經過三個階段:游離期、指數增生期和停止期。
常用細胞分裂指數表示細胞增殖的旺盛程度,即細胞群的分裂相數/100個細胞。一般細胞分裂指數介于0.2%~0.5%,腫瘤細胞可達3~5%。細胞接種2~3天分裂增殖旺盛,是活力**好時期,稱指數增生期(對數生長期),適宜進行各種試驗。
4.2.2 操作
①.將長成單層的原代培養細胞或HeLa細胞從二氧化碳培養箱中取出,在超凈工作臺中倒掉瓶內的培養液,加入少許消化液。(以液面蓋住細胞為宜),靜置5~10分鐘。
②.在倒置鏡下觀察被消化的細胞,如果細胞變園,相互之間不再連接成片,這時應立即
在超凈臺中將消化液倒掉,加入3~5ml新鮮培養液,吹打,制成細胞懸液。
③.將細胞懸液吸出2ml左右,加到另一個培養瓶中并向每個瓶中分別加3ml左右培養液,蓋好瓶塞,送回二氧化碳培養箱中,繼續進行培養。
4.2.3 結果
一般情況,傳代后的細胞在2小時左右就能附著在培養瓶壁上,2~4天就可在瓶內形成單層,需要再次進行傳代。
4.3 器材及液體的準備和無菌操作的注意事項
4.3.1 器材和液體的準備
細胞培養用的玻璃器材,如:培養瓶、吸管等在清洗干凈以后,裝在鋁盒和鐵筒中,120℃,2小時干烤滅菌后備用;手術器材、瓶塞、配制好的PBS液用滅菌鍋15磅,20分鐘蒸氣滅菌;MEM培養液、小牛血清、消化液用G6濾器負壓抽濾后備用。
4.3.2 無菌操作中的注意事項
在無菌操作中,一定要保持工作區的無菌清潔。為此,在操作前要認真地洗手并用75%乙醇消毒。操作前20~30分鐘起動超凈臺吹風。操作時,嚴禁說話,嚴禁用手直接拿無菌的物品,如瓶塞等,而要用器械,如止血鉗、鑷子等去拿。培養瓶要在超凈臺內才能打開瓶塞,打開之前用乙醇將瓶口消毒,打開后和加塞前瓶口都要在酒精燈上燒一下,打開瓶口后的操作全部都要在超凈臺內完成。操作完畢后,加上瓶塞,才能拿到超凈臺外。使用的吸管在從消毒的鐵筒中取出后要手拿末端,將**在火上燒一下,戴上膠皮乳頭,然后再去吸取液體??傊?,在整個無菌操作過程中都應該在酒精燈的周圍進行。
5.實驗報告
(1).原代細胞和傳代細胞培養有哪些區別?
(2).總結一下你自己的經驗,怎樣才能既迅速,又保證無菌操作。