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細(xì)胞培養(yǎng)之細(xì)胞計(jì)數(shù)

實(shí)驗(yàn)原理:當(dāng)待測細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí),通過測定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目,即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。
具體操作
一.準(zhǔn)備工作:
   取一瓶傳代的細(xì)胞,按照《傳代細(xì)胞培養(yǎng)(消化法)》中的傳代方法繁殖細(xì)胞,待長成單層后以被使用.
二.細(xì)胞懸液制備:
   用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后,加入培養(yǎng)液(或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液),吹打制成待測細(xì)胞懸液。
三.細(xì)胞計(jì)數(shù):
   1.取一套血球計(jì)數(shù)板,將特制的蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)槽上.
   2.制備計(jì)數(shù)用的細(xì)胞懸液:用吸管吸5滴細(xì)胞懸液到一離心管中,加入5滴臺(tái)盼藍(lán)染液(0.4%)或苯胺黑。活細(xì)胞不會(huì)被染色,加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。
  3.將細(xì)胞懸液滴入計(jì)數(shù)板:將待測細(xì)胞懸液吹均勻,然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入,要保證蓋片下充滿懸液,注意蓋片下不要有氣泡,也不能讓懸液流入旁邊槽中。
  4.統(tǒng)計(jì)四個(gè)大格的細(xì)胞數(shù):將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察,并移動(dòng)計(jì)數(shù)板,當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后,數(shù)出四角的四個(gè)大鉻(每個(gè)大格含有16個(gè)中鉻)中沒有被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目。
  5.計(jì)算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù):按照下面公式計(jì)算細(xì)胞密度:
細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)/ml=(四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4)×2×104
說明:/4因?yàn)橛?jì)數(shù)了4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù);×2因細(xì)胞懸液:染液=1:1稀釋;×104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為:1.0mm×1.0mm×0.1mm=0.1mm3 而 1ml=1000mm3  
四.細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn):
  1.進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí),要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104個(gè)/ml,如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中; 
  2.要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好,否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。
  3.取樣計(jì)數(shù)前,應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液,尤其時(shí)多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更要注意每次取樣都要混勻,以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確;
  4.數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞,若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí),只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞壓在格線上時(shí),則只計(jì)上線,不計(jì)下線,只計(jì)右線,不計(jì)左線。
  5. 操作時(shí),注意蓋片下不能有氣泡,也不能讓懸液流入旁邊槽中,否則要重新計(jì)數(shù)。
五.初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤:
  1. 計(jì)數(shù)前未將待測懸液吹打均勻。
  2. 滴入細(xì)胞懸液時(shí)蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。
  3. 滴入懸液時(shí)的量太多,**使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。 
六.本實(shí)驗(yàn)特殊試劑的配制:
4%臺(tái)盼藍(lán)母液:稱取4克臺(tái)盼藍(lán),加入少量蒸餾水研磨,加雙蒸水**100毫升,用濾紙過濾,4℃保存。
使用液:使用時(shí),用PBS稀釋母液**0.4%即可。
細(xì)胞的凍存
1.先將凍存管放入4℃冰箱,約40min。
2.接著置于-20℃冰箱,約30-60min。 
3.置于-80超低溫冰箱中放置過夜。 
4.置于液氮罐中長期保存。  
5同時(shí)做好凍存記錄,在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。  
注意事項(xiàng):
1.使用DMSO前,不需要進(jìn)行高壓滅菌,它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會(huì)破華它的分子結(jié)構(gòu),以**于降低冷凍保護(hù)效果。在常溫下,DMSO對(duì)人體有害,故在配制時(shí)**好戴上手套操作。 
2.不宜將凍存細(xì)胞放置在0℃~-60℃這一溫度范圍內(nèi)過久,低溫?fù)p傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū)內(nèi),是“危險(xiǎn)溫區(qū)”。
3.注意定期檢查液氮罐內(nèi)液氮量,及時(shí)添加。
簡便方法:
胰蛋白酶液消化>>離心>>PBS液1ml洗滌,吹打制成待測細(xì)胞懸液>>取1ul懸液+9ulPBS>>細(xì)胞計(jì)數(shù):
1.蓋好蓋玻片:取一套血球計(jì)數(shù)板,將特制的蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)槽上.
2.用10ul槍頭將細(xì)胞懸液注入計(jì)數(shù)板,要保證蓋片下充滿懸液,注意蓋片下不要有氣泡,也不能讓懸液流入旁邊槽中。
3.統(tǒng)計(jì)四個(gè)大格的細(xì)胞數(shù):將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察,并移動(dòng)計(jì)數(shù)板,當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后,數(shù)出四角的四個(gè)大鉻(每個(gè)大格含有16個(gè)中鉻)的細(xì)胞數(shù)目。
4.計(jì)算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù):按照下面公式計(jì)算細(xì)胞密度:

(細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù))/ml=(四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4)×106 
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