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比較細(xì)胞工廠與10L轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)Vero細(xì)胞和產(chǎn)毒情況

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br /> 1、了解熟悉細(xì)胞工廠的使用,清洗及再利用的方法;
2、比較細(xì)胞工廠與10L轉(zhuǎn)瓶同等條件下培養(yǎng)Vero細(xì)胞時(shí)各自細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài);
3、比較細(xì)胞工廠與10L轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)Vero細(xì)胞加毒之后細(xì)胞的狀態(tài)變化和產(chǎn)毒情況;
4、通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析用細(xì)胞工廠代替原有轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)優(yōu)缺點(diǎn);
5、通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞工廠中常見(jiàn)問(wèn)題。
二、主要實(shí)驗(yàn)工具及材料
干凈的10L轉(zhuǎn)瓶一個(gè)(表面積約為2278㎝2);
NUNC公司4層細(xì)胞工廠一個(gè)(表面積為2520㎝2,編號(hào):140360),自帶一個(gè)插拔塞和旋口塞
細(xì)胞生長(zhǎng)液;細(xì)胞維持液;毒種(CTN-1V株工作種子批毒種)
三、實(shí)驗(yàn)過(guò)程
(一)培養(yǎng)Vero細(xì)胞,觀察分析及注意事項(xiàng)
將一瓶已長(zhǎng)成致密單層細(xì)胞消化,制備成細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)后,按照每ml溶液含有1×105個(gè)細(xì)胞數(shù),及每平方厘米貼壁細(xì)胞數(shù)相同,根據(jù)面積比計(jì)算出加入ml數(shù)。加入細(xì)胞后放置于37℃恒溫室中培養(yǎng)。
細(xì)胞懸液濃度:2.32×106個(gè)/ml
 
  溶液總體積(ml) 加入細(xì)胞懸液體積(ml) 面積細(xì)胞數(shù)(個(gè)/cm2)
細(xì)胞工廠 800 34.48  
10L轉(zhuǎn)瓶 1500 31.03  
 
觀察、分析
2010-8-5
11:00   加入細(xì)胞和培養(yǎng)液于細(xì)胞工廠和10L轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)
13:30   觀察:細(xì)胞工廠中的貼壁細(xì)胞數(shù)量較10L轉(zhuǎn)瓶多,溶液中含有大量的懸浮細(xì)胞
分析:細(xì)胞工廠是靜置培養(yǎng),細(xì)胞貼壁較10L轉(zhuǎn)瓶快
 
2010-8-6
9:10觀察
細(xì)胞工廠:細(xì)胞狀態(tài)良好,已伸展,分布均勻
10L瓶:細(xì)胞狀態(tài)一般,少許伸展,分布稍有不均
分析:10L轉(zhuǎn)瓶中的細(xì)胞貼壁不均勻,可能是由于細(xì)胞總數(shù)較少造成
 
(二)加入病毒后,Vero細(xì)胞狀態(tài)的觀察分析
2010-8-9
9:30觀察(加毒前)
細(xì)胞工廠:細(xì)胞生長(zhǎng)成致密單層,間隙很小,排列整齊,分布均勻
10L轉(zhuǎn)瓶:細(xì)胞生長(zhǎng)成致密單層,間隙很小,排列較整齊,分布稍有不均勻
 
加毒前更換培養(yǎng)液為維持液,再根據(jù)比例加入3.1ml(10L轉(zhuǎn)瓶)3.4ml(細(xì)胞工廠)病毒
 
2010-8-10  9:00觀察
細(xì)胞工廠與轉(zhuǎn)瓶中的細(xì)胞無(wú)明顯變化,狀態(tài)正常,輪廓清晰
 
2010-8-11  9:30觀察
細(xì)胞工廠與轉(zhuǎn)瓶中的細(xì)胞狀態(tài)正常,無(wú)明顯病變,無(wú)懸浮細(xì)胞;10L轉(zhuǎn)瓶的顏色稍淺
 
2010-8-12  9:00觀察
細(xì)胞工廠與轉(zhuǎn)瓶中的細(xì)胞局問(wèn)成拉網(wǎng)狀,有少量懸浮細(xì)胞出現(xiàn),并且細(xì)胞工廠中的懸浮細(xì)胞較10L轉(zhuǎn)瓶多,細(xì)胞工廠中的PH維持正常,顏色無(wú)變化,10L轉(zhuǎn)瓶的PH維持不好,顏色變化明顯,PH下降明顯。
分析:細(xì)胞工廠較10L瓶透氣性好,所以PH維持得好
 
2010-8-13  9:15觀察
細(xì)胞工廠與轉(zhuǎn)瓶中的懸浮細(xì)胞數(shù)量增多,大部分細(xì)胞病變明顯,成拉網(wǎng)狀
 
(三)收獲病毒液
2010-8-16  9:30收獲病毒液前觀察
細(xì)胞工廠與10L轉(zhuǎn)瓶中有大量的懸浮細(xì)胞,考慮收獲病毒液。
收獲病毒液取樣:分別從細(xì)胞工廠和10L轉(zhuǎn)瓶中取樣于青霉素小瓶中,送樣檢測(cè)抗原和感染性滴度
 
四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析
抗原結(jié)果和滴度結(jié)果
此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,細(xì)胞工廠制備的狂犬病毒液,抗的含量和感染性滴度均好于轉(zhuǎn)瓶工藝制備的病毒液。可能與下述原因有一定關(guān)系:
(1)細(xì)胞工廠為靜止培養(yǎng)法,接種細(xì)胞后細(xì)胞貼壁良好,分布與較均勻,而轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞貼壁時(shí)間較長(zhǎng),并且稍有不均,因此在一定時(shí)間內(nèi),細(xì)胞工廠細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)稍好一些;
(2)10L瓶的細(xì)胞表面積少于細(xì)胞工廠,接種的細(xì)胞數(shù)是按面積計(jì)算,細(xì)胞工廠總細(xì)胞數(shù)多于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù);
(3)轉(zhuǎn)瓶工藝加毒時(shí)維持液1500ml,細(xì)胞工廠維持液是800ml。
因此,細(xì)胞工廠制備的病毒液的抗原含量和感染性滴度好于轉(zhuǎn)瓶工藝
在現(xiàn)有的條件下,很難找到與細(xì)胞工廠細(xì)胞生長(zhǎng)面積和維持液體積一致的對(duì)照方法,只能以細(xì)胞附著的單位面積,加入細(xì)胞數(shù)條件控制,但維持液的量則無(wú)法控制,只能按常規(guī)方法加入。
 
細(xì)胞工廠每層液面均分操作:
1、將培養(yǎng)基直接倒入細(xì)胞工廠;
2、將細(xì)胞工廠朝有小口的一面放置,平衡一段時(shí)間;
3、將細(xì)胞工廠翻轉(zhuǎn)90度,帶有進(jìn)液口的一面朝上,靜置一段時(shí)間,培養(yǎng)基便會(huì)自動(dòng)平均分配到每一層腔室中;
4、雙手握住進(jìn)液口的一面,緩慢地將細(xì)胞工廠放倒,變成水平放置,不要抓握**層邊緣,以防造成損壞。
 
注意事項(xiàng):
1、移動(dòng)細(xì)胞工廠的時(shí)候要盡量保持水平,否則會(huì)造成每層溶液不均勻;#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
2、放置細(xì)胞工廠的平臺(tái)或架子一定要水平,防止同層的細(xì)胞溶液厚度不同;
3、由于細(xì)胞工廠的進(jìn)液口是熔點(diǎn)低的材料制成,因此火焰保護(hù)時(shí)要小心,不要使之變形;
4、清洗細(xì)胞工廠時(shí),如用水流沖洗,切忌用較急的水流沖洗,否則將造成細(xì)胞工廠的損壞;
5、清洗后的細(xì)胞工廠放到鏡下觀察,還可看到少量的細(xì)胞殘留在上面,不易清洗下來(lái)。根據(jù)G內(nèi)其它企業(yè)的經(jīng)驗(yàn),細(xì)胞工廠可重復(fù)利用3-4次,但不能高壓消毒滅菌,需要通過(guò)鈷60照射之后再利用,增加成本;
6、四層細(xì)胞工廠放到鏡下觀察時(shí),只能看到**下一層細(xì)胞的狀態(tài)。10層或40層中細(xì)胞狀態(tài)的觀察則需要用四層細(xì)胞瓶對(duì)照觀察。
 
五、細(xì)胞工廠較現(xiàn)在轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)優(yōu)缺點(diǎn)
優(yōu)點(diǎn):1、節(jié)省人力、物力、時(shí)間、空間;
2、方便地按比例擴(kuò)增;
3、受污染風(fēng)險(xiǎn)低;
4、瓶間差異變小
缺點(diǎn):1、可重復(fù)利用的次數(shù)較少;
2、產(chǎn)品價(jià)格較貴;
3、消毒需要用鈷60照射;
4、清洗不方便;
5、細(xì)胞工廠量較少,按二次收獲,僅收獲1600ml,而轉(zhuǎn)瓶可收3000ml;此次細(xì)胞工廠滴度較高可許與其收量低有關(guān)
 
六、總結(jié)
細(xì)胞工廠做為一個(gè)可用于大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)裝置,具有很多的方便于細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn),會(huì)給整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程節(jié)省人力,時(shí)間,空間。但是對(duì)于Vero細(xì)胞的加毒產(chǎn)毒過(guò)程還存在許多細(xì)胞問(wèn)題。能否用于疫苗生產(chǎn),還需要考慮和解決更多的難點(diǎn)。
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