實驗方法
Ø
各種溶液的配制
1、 配制D-Hanks液(無鈣鎂)1L,PH8-9
(1) 稱量Nacl8.0g,kcl0.4g,Na
2Hpo
4.H
2o 0.06g, kH
2po
40.06g, NaHco
30.35g,酚紅0.02g
(2) 依次將各成分逐個溶解于800ml水中。
(3) 用5.6% NaHco
3溶解酚紅0.02克。
(4) 將酚紅液(3)加入(2)中。
(5) 補加水**1000ml,混勻。
(6) 將Hanks液分裝鹽水瓶內(nèi),110℃、8鎊高壓蒸汽消毒滅菌20分鐘,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br />
2、 配制0.25%胰蛋白酶溶液75ml
(1)稱取胰蛋白酶187.5mg,用少量D-Hanks液先將胰蛋白酶粉末調(diào)成糊狀。
(2)補足Hanks液**75ml,攪拌混勻,置40℃水浴攪拌幫助溶解。
(3)冷卻**室溫后,置4℃冰箱過夜。
(4)用濾紙粗濾,再用0.22μm微孔過濾膜過濾除菌。
(5)分裝小瓶,低溫冰箱冰凍保存?zhèn)溆谩?br />
3、 配制0.3%Ⅱ型膠原酶溶液49.5ml
(1)稱取Ⅱ型膠原酶150mg,用D-Hanks液溶解。
(2)補足Hanks液**49.5ml,攪拌混勻。
(3)用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。
(4)分裝小瓶,低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?br />
4、 配制閃爍液
(1)用電子天平稱取POPOP 0.2g,PPO 2.0g。
(2)將上二者溶解在500ml二甲苯中,避光保存,備用。
Ø
取材與培養(yǎng)
(1)取3kg重6月齡青紫藍兔一只(購自shou都醫(yī)科大學動物房),兔耳靜脈注射5ml空氣致死。
(2)無菌條件下取雙側(cè)下肢膝,髖關(guān)節(jié)面軟骨,置于D-Hanks液中漂洗2次,并用眼科剪將軟骨剪碎**1mm
3大小,繼續(xù)用D-Hanks液漂洗2次。
(3)吸去漂洗液,加入0.25%胰蛋白酶溶液,并置入37℃、5%CO
2孵箱中消化30分鐘,中途不時搖晃。
(4) 吸出胰蛋白酶溶液,加入0.3%Ⅱ型膠原酶溶液,置入37℃、5%CO
2孵箱中繼續(xù)消化3小時。每1小時更換Ⅱ型膠原酶溶液1次。用離心管留取各次消化液,離心2000rpmX10min,去除上清液。
(5) 用加了青霉素及鏈霉素的Hanks液洗1次,以同樣方法再離心一次。
(6) 過120目紗目,去除上清液。
(7) 用含10%FBS的DMEM制成細胞懸液,調(diào)細胞懸液濃度**7.5X10
4。
(8) 將細胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板(1ml)及96孔培養(yǎng)板(200μm)中,24孔板及96孔板各2板。
(9) 置于37℃、5%CO
2孵箱中培養(yǎng)48小時。
Ø
更換部分培養(yǎng)基
(1) 用移液槍從24孔培養(yǎng)板中每孔吸出0.5ml舊的培養(yǎng)基,更換同等數(shù)量新的培養(yǎng)基。
(2)同法從96孔培養(yǎng)板中每孔吸出100μl舊的培養(yǎng)基,更換同等數(shù)量新的培養(yǎng)基。
Ø
加藥
按照預前設計給培養(yǎng)孔中加A藥(牛膝健步)及B藥(鹿茸生長素),具體加藥方法如下圖。
具體加藥情況
每支鹿茸生長素加1mlDMEM稀釋,PH7.0 (DMEM PH7.2)
藥 品 |
培養(yǎng)板 |
大劑量 |
中劑量 |
小劑量 |
A藥(牛膝健步) |
96孔板 |
10μl |
8μl |
6μl |
A藥(牛膝健步) |
24孔板 |
50μl |
40μl |
30μl |
B藥(鹿茸) |
96孔板 |
30μl |
20μl |
10μl |
B藥(鹿茸) |
24孔板 |
150μl |
100μl |
50μl |
鹿茸大劑量的濃度為0.12%,中劑量的濃度為0.08%,小劑量的濃度為0.04%。
測定
Ø
測II膠原的合成
關(guān)節(jié)軟骨細胞DNA的合成用
3H TdR的摻入量來檢測。
3號板加藥后48小時加同位素
3H TdR及
3H脯氨酸
(1)用1ml注射器抽取0.1ml
3H TdR (即0.1μci)(
3H TdR及
3H脯氨酸購買時濃度為 1mci/ml)。
(2) 加DMEM**0.5ml,將
3H TdR配制成0.2 mci/ml濃度。
(3) 同法配制相同數(shù)量的
3H脯氨酸。
(4) 根據(jù)試驗前設計,按每孔5μl(即1μci)的量加入同位素。
(5) 置于37℃、5%CO
2孵箱中培育12小時。
Ø #p#分頁標題#e#
測定同位素的量
固定3號板細胞,測定同位素的量
1、配置0.25%胰蛋白酶溶液
(1)用電子天平稱取0.25g胰蛋酶,放入燒杯內(nèi)。
(2)加入少量的D-Hanks液,充分攪拌,使其成糊狀。
(3)再加入D-Hanks液**100ml,不停攪拌,直**完全溶解。
2、固定細胞
(1)用移液管將3號板(加藥后48小時加同位素)各孔的培養(yǎng)液按順序吸出并置入相應的試管內(nèi)。
(1) 往各孔內(nèi)加入少量的0.25%胰蛋白酶溶液,并同時吹打細胞,使貼壁細胞消化脫落,消化不少于5分鐘,形成細胞懸液,將細胞懸液再依次加入上面的相應試管內(nèi)。
(2) 將真空泵與玻璃纖維濾膜連接。
(3) 用滴管依次將試管中的液體吸盡,滴加在玻璃纖維濾膜上,真空抽吸過濾。
(4) 用注射器分別依次抽取2ml 5%三氯乙酸(細胞固定)、5ml蒸餾水(洗去多余的同位素)、1ml無水乙醇(細胞脫色),依次加**濾膜,使細胞固定在濾膜上。
(5) 待真空泵將濾膜上的液體吸盡后,用鑷子將濾膜取下,有序的置于托盤內(nèi)。
(7)同上述3號板方法,根據(jù)試驗前設計往4號板各培養(yǎng)孔中加入5μl(1μci)
3H TdR或
3H脯氨酸,并置于37℃、5%CO
2孵箱中培育12小時。
(8) 同昨日方法固定4號板細胞。
(9)將固定3號板及4號板細胞的濾膜依次置入對應的裝有閃爍液的小塑料瓶內(nèi),閃爍
液要覆蓋濾膜。
3、 用美G產(chǎn)BECKMAN LS6500 multi-purpose 液閃儀測定各孔細胞
3H TdR或
3H脯氨酸的摻入值。
Ø
MTT法測細胞增殖
MTT染色
(1) 用電子天平稱量MTT染料0.02g。
(2)用DMEM溶解并稀釋**4ml,PH值測定7.2。
(3)用0.22μm濾膜過濾除菌。
(4)根據(jù)試驗前設計,往1號板與2號板相應的培養(yǎng)孔內(nèi),按0.1ml/孔加入MTT染色液。
(5)置于37℃、5%CO
2孵箱中培育5小時。
(6)按二甲基甲酰胺:Triton-X100:水=3:1:2的比例配置42ml脫色液(用檸檬酸調(diào)節(jié)PH**5~6)。
(7)按每孔1ml將脫色液加**1號及2號培養(yǎng)板相應的培養(yǎng)孔中。
(8)置于37℃、5%CO
2孵箱中培育3小時,期間間歇振蕩十分鐘,使結(jié)晶充分溶解。
(9)用移液槍在1號板與2號板各孔中抽吸0.2ml溶液按順序加入96板培養(yǎng)孔中。
(10)選擇570nm波長,在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔的光吸收值。
Ø
甲苯胺藍染色及蛋白多糖的測定
甲苯胺藍染色
1、試劑配制:甲苯胺藍乙醇液(甲苯胺藍0.2g溶于30%乙醇100ml中)。
2、根據(jù)試驗前設計,將行甲苯胺藍染色的培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液吸去。
3、用PBS漂洗二次。
4、用70%乙醇固定30分鐘。
5、用甲苯胺藍乙醇液染20分鐘。
6、倒置顯微鏡下觀察并照相。
由于35-硫同位素試劑**今未買到,故軟骨細胞體外培養(yǎng)后蛋白多糖的測定用甲苯胺藍染色法完成。軟骨2-型膠原的合成用同位素標記的脯氨酸摻入量進行檢測。
Ø
組織胺誘導軟骨細胞凋亡及吖啶橙染色
1 根據(jù)預前設計,往培養(yǎng)孔中加入30μl組織胺,置于37℃、5%CO
2孵箱中繼續(xù)培育24小時。
2 細胞離心,去上清后將細胞懸浮于50μlPBS中。
3 加入100μl吖啶橙染色液,混勻,置于冰中染色30分鐘。
4 加入1。85ml細胞固定液,混勻。
5 倒置顯微鏡觀察。
6 進行流式細胞儀分析。
試劑
DMEM培養(yǎng)基(Gibco)
胎牛血清(FBS):五江制藥廠
Ⅱ型膠原酶:Sigma,北京吉泰聯(lián)科公司分裝
0.3%Ⅱ型膠原酶:取100mg膠原酶加入33ml D-Hanks液,0.22μm濾膜過濾;
DMEM培養(yǎng)液:90mlDMEM+10mlFBS+0.1ml青霉素+0.1ml鏈霉素
青霉素160萬
u加Hanks16ml,即10萬
u/ml
鏈霉素100萬
u加Hanks10ml,即10萬
u/ml
Trypsin(胰蛋白酶):Gibco,邦定分裝
0.25%Trypsin:0.125g Trypsin加入50ml D-Hanks液中
實驗過程
2002年12月13日 星期五
一、 配制D-Hanks液(無鈣鎂)1L,PH8-9
1、 稱量Nacl8.0g,kcl0.4g,Na
2Hpo
4﹒H
2o 0.06g, kH
2po
40.06g,NaHco
30.35g,酚紅0.02g
2、 依次將各成分逐個溶解于800ml水中。
3、 用5.6% NaHco
3溶解酚紅0.02克。
4、 將酚紅液(3)加入(2)中。
5、 補加水**1000ml,混勻。
6、 將Hanks液分裝鹽水瓶內(nèi),110℃、8鎊高壓蒸汽消毒滅菌20分鐘,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br />
二、 配制0.25%胰蛋白酶溶液75ml
1、 稱取胰蛋白酶187.5mg,用少量D-Hanks液先將胰蛋白酶粉末調(diào)成糊狀。
2、補足Hanks液**75ml,攪拌混勻,置40℃水浴攪拌幫助溶解。
3、冷卻**室溫后,置4℃冰箱過夜。
4、用濾紙粗濾,再用0.22μm微孔過濾膜過濾除菌。
5、分裝小瓶,低溫冰箱冰凍保存?zhèn)溆谩?p#分頁標題#e#
三、 配制0.3%Ⅱ型膠原酶溶液49.5ml
1、 稱取Ⅱ型膠原酶150mg,用D-Hanks液溶解。
2、 補足Hanks液**49.5ml,攪拌混勻。
3、 用0.22μm微孔濾膜過濾除菌。
4、 分裝小瓶,低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?br />
四、 取材
1、 取3kg重6月齡青紫藍兔一只(購自shou都醫(yī)科大學動物房),兔耳靜脈注射5ml空氣致死。
2、 無菌條件下取雙側(cè)下肢膝,髖關(guān)節(jié)面軟骨,置于D-Hanks液中漂洗2次,并用眼科剪將軟骨剪碎**1mm
3大小,繼續(xù)用D-Hanks液漂洗2次。
3、 吸去漂洗液,加入0.25%胰蛋白酶溶液,并置入37℃、5%CO
2孵箱中消化30分鐘,中途不時搖晃。
4、 吸出胰蛋白酶溶液,加入0.3%Ⅱ型膠原酶溶液,置入37℃、5%CO
2孵箱中繼續(xù)消化3小時。每1小時更換Ⅱ型膠原酶溶液1次。用離心管留取各次消化液,離心2000rpmX10min,去除上清液。
5、 用加了青霉素及鏈霉素的Hanks液洗1次,以同樣方法再離心一次。
6、 過120目紗目,去除上清液。
7、 用含10%FBS的DMEM制成細胞懸液,調(diào)細胞懸液濃度**7.5X10
4。
8、 將細胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板(1ml)及96孔培養(yǎng)板(200μm)中,24孔板及96孔板各2板。
9、 置于37℃、5%CO
2孵箱中培養(yǎng)48小時。
2002年12月6日 星期一
一、 更換部分培養(yǎng)基
1、 用移液槍從24孔培養(yǎng)板中每孔吸出0.5ml舊的培養(yǎng)基,更換同等數(shù)量新的培養(yǎng)基。
2、 同法從96孔培養(yǎng)板中每孔吸出100μl舊的培養(yǎng)基,更換同等數(shù)量新的培養(yǎng)基。
二、 加藥:按照預前設計給培養(yǎng)孔中加A藥(牛膝健步)及B藥(鹿茸生長素),具體加藥方法如下圖。
具體加藥情況
每支鹿茸生長素加1mlDMEM稀釋,PH7.0 (DMEM PH7.2)
藥 品 |
培養(yǎng)板 |
大劑量 |
中劑量 |
小劑量 |
A藥(牛膝健步) |
96孔板 |
10μl |
8μl |
6μl |
A藥(牛膝健步) |
24孔板 |
50μl |
40μl |
30μl |
B藥(鹿茸) |
96孔板 |
30μl |
20μl |
10μl |
B藥(鹿茸) |
24孔板 |
150μl |
100μl |
50μl |
鹿茸大劑量的濃度為0.12%,中劑量的濃度為0.08%,小劑量的濃度為0.04%。
2002年12月17日 星期二
一、 配制閃爍液
1、 用電子天平稱取POPOP 0.2g,PPO 2.0g。
2、 將上二者溶解在500ml二甲苯中,避光保存,備用。
2002年12月18日 星期三
一、 3號板加藥后48小時加同位素
3H TdR及
3H脯氨酸
1、 用1ml注射器抽取0.1ml
3H TdR (即0.1μci)(
3H TdR及
3H脯氨酸購買時濃度為1mci/ml)。
2、 加DMEM**0.5ml,將
3H TdR配制成0.2 mci/ml濃度。
3、 同法配制相同數(shù)量的
3H脯氨酸。
4、 根據(jù)試驗前設計,按每孔5μl(即1μci)的量加入同位素。
5、 置于37℃、5%CO
2孵箱中培育12小時。
2002年12月19日 星期四
一、 MTT染色
1、 用電子天平稱量MTT染料0.02g。
2、 用DMEM溶解并稀釋**4ml,PH值測定7.2。
3、 用0.22μm濾膜過濾除菌。
4、 根據(jù)試驗前設計,往1號板與2號板相應的培養(yǎng)孔內(nèi),按0.1ml/孔加入MTT染色液。
5、 置于37℃、5%CO
2孵箱中培育5小時。
6、 按二甲基甲酰胺:Triton-X100:水=3:1:2的比例配置42ml脫色液(用檸檬酸調(diào)節(jié)PH**5~6)。
7、 按每孔1ml將脫色液加**1號及2號培養(yǎng)板相應的培養(yǎng)孔中。
8、 置于37℃、5%CO
2孵箱中培育3小時,期間間歇振蕩十分鐘,使結(jié)晶充分溶解。#p#分頁標題#e#
9、 用移液槍在1號板與2號板各孔中抽吸0.2ml溶液按順序加入96板培養(yǎng)孔中。
10、 選擇570nm波長,在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔的光吸收值。
二、 固定3號板細胞,測定同位素的量
(一) 配置0.25%胰蛋白酶溶液
1、 用電子天平稱取0.25g胰蛋酶,放入燒杯內(nèi)。
2、 加入少量的D-Hanks液,充分攪拌,使其成糊狀。
3、 再加入D-Hanks液**100ml,不停攪拌,直**完全溶解。
(二) 固定細胞
1、 用移液管將3號板(加藥后48小時加同位素)各孔的培養(yǎng)液按順序吸出并置入相應的試管內(nèi)。
2、 往各孔內(nèi)加入少量的0.25%胰蛋白酶溶液,并同時吹打細胞,使貼壁細胞消化脫落,消化不少于5分鐘,形成細胞懸液,將細胞懸液再依次加入上面的相應試管內(nèi)。
3、 將真空泵與玻璃纖維濾膜連接。
4、 用滴管依次將試管中的液體吸盡,滴加在玻璃纖維濾膜上,真空抽吸過濾。
5、 用注射器分別依次抽取2ml 5%三氯乙酸(細胞固定)、5ml蒸餾水(洗去多余的同位素)、1ml無水乙醇(細胞脫色),依次加**濾膜,使細胞固定在濾膜上。
6、 待真空泵將濾膜上的液體吸盡后,用鑷子將濾膜取下,有序的置于托盤內(nèi)。
三、 同昨日3號板方法,根據(jù)試驗前設計往4號板各培養(yǎng)孔中加入5μl(1μci)
3H TdR或
3H脯氨酸,并置于37℃、5%CO
2孵箱中培育12小時。
四、甲苯胺藍染色
1、試劑配制:甲苯胺藍乙醇液(甲苯胺藍0.2g溶于30%乙醇100ml中)。
2、根據(jù)試驗前設計,將行甲苯胺藍染色的培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液吸去。
3、用PBS漂洗二次。
4、用70%乙醇固定30分鐘。
4、 用甲苯胺藍乙醇液染20分鐘。
5、 倒置顯微鏡下觀察并照相。
2002年12月20日 星期五
一、 同昨日方法固定4號板細胞。
二、 將固定3號板及4號板細胞的濾膜依次置入對應的裝有閃爍液的小塑料瓶內(nèi),閃爍液要覆蓋濾膜。
三、 用美G產(chǎn)BECKMAN LS6500 multi-purpose 液閃儀測定各孔細胞
3H TdR或
3H脯氨酸的摻入值。
[題名]人關(guān)節(jié)軟骨細胞培養(yǎng)法的改良及其特有表型的檢測
[外文題名]The modified chondrocyte culture method and inspection of cell's pheno
type
[作者]宋衛(wèi)東, 劉尚禮, 李衛(wèi)平, 沈慧勇, 黃東生, 黃建榮
[單位]廣東 廣州中山大學附屬第二醫(yī)院骨科 510120
[出處]中華實驗外科雜志 2003V20N2 147-148
[資助]G家自然科學青年基金資助項目 (30100188)
[關(guān)鍵詞]軟骨細胞, 培養(yǎng), 表型
[摘要]目的:探討簡便、易行的人關(guān)節(jié)軟骨細胞體外培養(yǎng)方法。方法:以0.25%胰酶消化軟骨塊
0.5 h,0.30%膠原酶消化4 h后,將軟骨細胞與小片軟骨(0.2 mm^3|大小)共同置入預涂多聚賴氨
酸的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng);與傳統(tǒng)方法對照,用倒置顯微鏡、免疫組織化學、電鏡、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈
反應(RT-PCR)等方法,檢測經(jīng)7次傳代后軟骨細胞表型改變相伴隨的形態(tài)學及分子生物學特征
。結(jié)果:改良法培養(yǎng)的細胞活性率可達100%。經(jīng)多次傳代的軟骨細胞仍保持原代軟骨細胞的表
型特征,甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色陽性,并可觀察到軟骨的特有的細胞-膠原
纖維幾何構(gòu)像。而傳統(tǒng)法培養(yǎng)的軟骨細胞在第7代特有表型出現(xiàn)改變。結(jié)論:本改良法是一種較
方便而且有效的培養(yǎng)法。
[參考文獻]4
[題名]軟骨細胞凋亡與骨關(guān)節(jié)炎
[作者]向川
[單位]湖北 武漢華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科 430022
[出處]G外醫(yī)學·免疫學分冊 2003V26N2 110-封三
[關(guān)鍵詞]軟骨細胞, 凋亡, 骨關(guān)節(jié)炎
[摘要]骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種老年人常見的關(guān)節(jié)疾患,近年研究顯示,軟骨細胞過度凋亡可能在
OA的發(fā)病中產(chǎn)生了重要影響。在OA中,軟骨細胞凋亡多通過NO途徑和Fas途徑發(fā)生,并且受IL-1
β、TNF-α、IL-8、bcl-2等因素的影響。闡明軟骨細胞凋亡在OA的發(fā)病機制中的作用,將有助
于OA的防治。
[文獻類型]綜述