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Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞消化傳代
Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)48-72小時(shí)后,將細(xì)胞用0.2%的胰酶消化后以1:3的比例傳代。細(xì)胞培養(yǎng)液(6%小牛血清、1%雙抗、93%DMEM培養(yǎng)液),細(xì)胞維持液(3%小牛血清、1%雙抗、96%DMEM培養(yǎng)液)。
細(xì)胞凍存(15ml中號(hào)培養(yǎng)瓶)
將細(xì)胞形態(tài)較好,細(xì)胞活力旺盛(即傳代后36-48小時(shí)細(xì)胞長(zhǎng)成單層面)用0.2%的胰酶
消化后加入細(xì)胞凍存液20ml(30%小牛血清、10%二甲基亞砜DMSO、60%DMEM培養(yǎng)液),混勻后2ml/管分裝,放入細(xì)胞凍存盒置-70℃冰箱72小時(shí)后放入液氮罐保存。
細(xì)胞復(fù)蘇
將液氮罐中的細(xì)胞快速取出,置37℃溫水中解凍,再將解凍后的細(xì)胞1000轉(zhuǎn)離心5分鐘,在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)小心倒掉上清,加入1ml細(xì)胞培養(yǎng)液后吹打混勻,吸入到5ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),在加入5ml細(xì)胞培養(yǎng)液。
 
 
marc 145細(xì)胞培養(yǎng)的簡(jiǎn)單綜述
2008-07-25 00:00   來(lái)源:丁香園   點(diǎn)擊次數(shù):1930 關(guān)鍵詞: marc 145細(xì)胞 細(xì)胞培養(yǎng) 綜述
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一、 細(xì)胞及培養(yǎng)
 
1、Marc145細(xì)胞
 
上皮樣細(xì)胞,來(lái)源于猴腎細(xì)胞,從母細(xì)胞(MA 104細(xì)胞)克隆而得到,可連續(xù)培養(yǎng)。
 
2、生長(zhǎng)培養(yǎng)基
 
DMEM(高糖型,含4500mg/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺,和110mg/L丙酮酸鈉,不含碳酸氫鈉)+5-10%新生牛血清+ 1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的培養(yǎng)液。
 
3、凍存液
 
生長(zhǎng)培養(yǎng)基+10% DMSO
 
4、細(xì)胞健康生長(zhǎng)的幾項(xiàng)注意事項(xiàng)
 
(1)細(xì)胞沒(méi)有支原體等外源因子的感染。
 
(2)培養(yǎng)液的pH值可在7.0-7.3,以7.2為佳。
 
(3)一般按1:3傳代,細(xì)胞接種密度為1-1.5×105cells/ml,48hr后長(zhǎng)成單層。
 
(4)培養(yǎng)基和血清的質(zhì)量可靠、穩(wěn)定;建議采用特級(jí)小牛血清。
 
(5)細(xì)胞及時(shí)傳代,不可以在老化后傳代,一般在剛長(zhǎng)成細(xì)胞單層時(shí)進(jìn)行傳代、擴(kuò)增。
 
(6)細(xì)胞傳代時(shí)消化液用0.25%胰蛋白酶+0.03%EDTA,消化過(guò)程應(yīng)盡量縮短在1~2分鐘內(nèi)完成。
 
二、 病毒感染、維持和收獲
 
轉(zhuǎn)瓶中細(xì)胞長(zhǎng)成單層后,棄瓶?jī)?nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)液,接種PRRS病毒。37℃吸附1hr,加入維持液,置37℃恒溫室轉(zhuǎn)瓶機(jī)上旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)3-5天。
 
維持液:DMEM+4~5%新生牛血清。
 
pH應(yīng)為7.4~7.8;后期維持pH會(huì)慢慢降下來(lái)。
 
細(xì)胞病變時(shí)間出現(xiàn)在接毒后48小時(shí),72~96小時(shí)細(xì)胞病變達(dá)80%左右,當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)80%以上病變(CPE)時(shí),即可開(kāi)始收毒;反復(fù)傳過(guò)幾代后病變時(shí)間可縮短。
 
第3、4天注意觀察,細(xì)胞病變(CPE)達(dá)到80%時(shí)收獲病毒,-20℃凍融3次,混勻病毒懸液,96孔板測(cè)定TCID50。
 
收液時(shí)需要將含毒細(xì)胞反復(fù)凍融2~3次以破碎細(xì)胞,將病毒釋放到培養(yǎng)液中。
 
三、 細(xì)胞病變(CPE)
 
細(xì)胞在接種病毒后,24-48hr開(kāi)始出現(xiàn)病變,72-96hr約達(dá)到80%病變。病變現(xiàn)象:細(xì)胞空泡化、圓縮、先灶狀脫落,再大片脫落,**后整個(gè)細(xì)胞裂解、破碎。圖1是指PRRSV感染后,出現(xiàn)細(xì)胞病變的Marc 145細(xì)胞。
 
四、 PRRS病毒在細(xì)胞中增殖規(guī)律( Virology Journal, 2006, 3: 90)
 
PRRS病毒感染Marc 145細(xì)胞過(guò)程可大致分為兩個(gè)感染階段,**階段:病毒感染細(xì)胞后的20-22hr左右,僅部分細(xì)胞被隨機(jī)感染,而且Marc 145細(xì)胞對(duì)PRRS病毒的低感染性(low permissiveness)與MOI量無(wú)關(guān),因?yàn)镸OI劑量比常規(guī)量提高100倍,感染22hr后,仍僅5.5%的細(xì)胞呈PRRSV陽(yáng)性(PRRSV-positive)。第二階段:感染后的2-3天(也稱為病毒的對(duì)數(shù)感染期),病毒感染蔓延是通過(guò)相鄰細(xì)胞和細(xì)胞之間的接觸感染,細(xì)胞對(duì)自由病毒不敏感(Cells is nonpermissive to free Virus),并出現(xiàn)了感染細(xì)胞群。 感染過(guò)程如圖5所示。
 
對(duì)我們的一點(diǎn)啟示:可以采用適當(dāng)?shù)土康腗OI進(jìn)行病毒感染,比如0.05virus/cell;同時(shí),大部分細(xì)胞在維持期的**天尚需繼續(xù)生長(zhǎng),而且病毒在2-4天才是感染、增殖的高峰,較長(zhǎng)的病毒維持期均需要供給豐富的營(yíng)養(yǎng)物資,可以相信:維持液的營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)病毒增殖效率有非常重要的影響。
 
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