細(xì)胞消化傳代
Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)48-72小時(shí)后，將細(xì)胞用0.2%的胰酶消化后以1：3的比例傳代。細(xì)胞培養(yǎng)液（6%小牛血清、1%雙抗、93%DMEM培養(yǎng)液），細(xì)胞維持液（3%小牛血清、1%雙抗、96%DMEM培養(yǎng)液）。
細(xì)胞凍存（15ml中號(hào)培養(yǎng)瓶）
將細(xì)胞形態(tài)較好，細(xì)胞活力旺盛（即傳代后36-48小時(shí)細(xì)胞長(zhǎng)成單層面）用0.2%的胰酶
消化后加入細(xì)胞凍存液20ml（30%小牛血清、10%二甲基亞砜DMSO、60%DMEM培養(yǎng)液），混勻后2ml/管分裝，放入細(xì)胞凍存盒置-70℃冰箱72小時(shí)后放入液氮罐保存。
細(xì)胞復(fù)蘇
將液氮罐中的細(xì)胞快速取出，置37℃溫水中解凍，再將解凍后的細(xì)胞1000轉(zhuǎn)離心5分鐘，在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)小心倒掉上清，加入1ml細(xì)胞培養(yǎng)液后吹打混勻，吸入到5ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，在加入5ml細(xì)胞培養(yǎng)液。
 
 
marc 145細(xì)胞培養(yǎng)的簡(jiǎn)單綜述
2008-07-25 00:00   來(lái)源：丁香園   點(diǎn)擊次數(shù)：1930 關(guān)鍵詞： marc 145細(xì)胞 細(xì)胞培養(yǎng) 綜述
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一、 細(xì)胞及培養(yǎng)
 
1、Marc145細(xì)胞
 
上皮樣細(xì)胞，來(lái)源于猴腎細(xì)胞，從母細(xì)胞（MA 104細(xì)胞）克隆而得到，可連續(xù)培養(yǎng)。
 
2、生長(zhǎng)培養(yǎng)基
 
DMEM（高糖型，含4500mg/L D－葡萄糖、L-谷氨酰胺，和110mg/L丙酮酸鈉，不含碳酸氫鈉）＋5－10％新生牛血清+ 1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的培養(yǎng)液。
 
3、凍存液
 
生長(zhǎng)培養(yǎng)基＋10% DMSO
 
4、細(xì)胞健康生長(zhǎng)的幾項(xiàng)注意事項(xiàng)
 
（1）細(xì)胞沒(méi)有支原體等外源因子的感染。
 
（2）培養(yǎng)液的pH值可在7.0－7.3，以7.2為佳。
 
（3）一般按1：3傳代，細(xì)胞接種密度為1－1.5×105cells/ml，48hr后長(zhǎng)成單層。
 
（4）培養(yǎng)基和血清的質(zhì)量可靠、穩(wěn)定；建議采用特級(jí)小牛血清。
 
（5）細(xì)胞及時(shí)傳代，不可以在老化后傳代，一般在剛長(zhǎng)成細(xì)胞單層時(shí)進(jìn)行傳代、擴(kuò)增。
 
（6）細(xì)胞傳代時(shí)消化液用0.25%胰蛋白酶+0.03%EDTA，消化過(guò)程應(yīng)盡量縮短在1～2分鐘內(nèi)完成。
 
二、 病毒感染、維持和收獲
 
轉(zhuǎn)瓶中細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，棄瓶?jī)?nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)液，接種PRRS病毒。37℃吸附1hr，加入維持液，置37℃恒溫室轉(zhuǎn)瓶機(jī)上旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)3－5天。
 
維持液：DMEM+4～5％新生牛血清。
 
pH應(yīng)為7.4～7.8；后期維持pH會(huì)慢慢降下來(lái)。
 
細(xì)胞病變時(shí)間出現(xiàn)在接毒后48小時(shí)，72～96小時(shí)細(xì)胞病變達(dá)80％左右，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)80%以上病變（CPE）時(shí)，即可開(kāi)始收毒；反復(fù)傳過(guò)幾代后病變時(shí)間可縮短。
 
第3、4天注意觀察，細(xì)胞病變（CPE）達(dá)到80％時(shí)收獲病毒，－20℃凍融3次，混勻病毒懸液，96孔板測(cè)定TCID50。
 
收液時(shí)需要將含毒細(xì)胞反復(fù)凍融2～3次以破碎細(xì)胞，將病毒釋放到培養(yǎng)液中。
 
三、 細(xì)胞病變（CPE）
 
細(xì)胞在接種病毒后，24－48hr開(kāi)始出現(xiàn)病變，72－96hr約達(dá)到80％病變。病變現(xiàn)象：細(xì)胞空泡化、圓縮、先灶狀脫落，再大片脫落，**后整個(gè)細(xì)胞裂解、破碎。圖1是指PRRSV感染后，出現(xiàn)細(xì)胞病變的Marc 145細(xì)胞。
 
四、 PRRS病毒在細(xì)胞中增殖規(guī)律（ Virology Journal, 2006, 3: 90）
 
PRRS病毒感染Marc 145細(xì)胞過(guò)程可大致分為兩個(gè)感染階段，**階段：病毒感染細(xì)胞后的20－22hr左右，僅部分細(xì)胞被隨機(jī)感染，而且Marc 145細(xì)胞對(duì)PRRS病毒的低感染性（low permissiveness）與MOI量無(wú)關(guān)，因?yàn)镸OI劑量比常規(guī)量提高100倍，感染22hr后，仍僅5.5%的細(xì)胞呈PRRSV陽(yáng)性（PRRSV-positive）。第二階段：感染后的2－3天（也稱為病毒的對(duì)數(shù)感染期），病毒感染蔓延是通過(guò)相鄰細(xì)胞和細(xì)胞之間的接觸感染，細(xì)胞對(duì)自由病毒不敏感（Cells is nonpermissive to free Virus），并出現(xiàn)了感染細(xì)胞群。 感染過(guò)程如圖5所示。
 
對(duì)我們的一點(diǎn)啟示：可以采用適當(dāng)?shù)土康腗OI進(jìn)行病毒感染，比如0.05virus/cell；同時(shí)，大部分細(xì)胞在維持期的**天尚需繼續(xù)生長(zhǎng)，而且病毒在2－4天才是感染、增殖的高峰，較長(zhǎng)的病毒維持期均需要供給豐富的營(yíng)養(yǎng)物資，可以相信：維持液的營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)病毒增殖效率有非常重要的影響。